Caractérisation génomique et développement d’outils de construction de clones infectieux pour l’étude de flexivirus

Abstract

La famille des Flexiviridae a été créée en 2004 et regroupe plusieurs genres viraux affectant particulièrement des espèces ligneuses dont des arbres fruitiers. Grâce à diverses approches plusieurs nouveaux Flexiviridae ont été partiellement caractérisés au cours de ces dernières années. En revanche la position taxonomique précise de certains d’entre eux et leur contribution à des pathologies particulières restent encore incertaines du fait de difficultés inhérentes à l’étude de ces agents. Dans le présent travail, nous avons obtenu les séquences génomiques complètes pour quatre agents proches de l’Apricot latent virus. Ceci a permis de préciser l’organisation génomique de ces virus et d’en déterminer la position taxonomique. Cette étude a également permis de montrer que la partie C-terminale de la capside et la protéine TGBp1 sont soumises à une pression sélective particulièrement forte. Dans un second volet de ce travail, plusieurs approches permettant l’obtention simple et rapide d’ADNc infectieux, sous forme clonée ou non ont été développées. Travaillant sur plusieurs Flexiviridae, dont le virus des taches foliaires chlorotiques du pommier (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV), nous avons mis au point l’amplification d’ADNc génomiques complets en une seule étape à partir d’extraits d’acides nucléiques totaux obtenus à partir de plantes infectées. Des amplifiats comportant l’ADNc viral sous le contrôle du promoteur 35S du CaMV ou du promoteur de la RNA polymérase du phage T7 ont été obtenus et utilisés pour infecter des plantes directement par biolistique (promoteur 35S) ou pour obtenir des ARN infectieux par transcription in vitro (promoteur T7). Ces données ont mis en évidence des différences importantes dans le comportement de deux hôtes de l’ACLSV, Chenopodium quinoa et Nicotiana occidentalis 37B. Nous avons également utilisé le système de recombinaison homologue de la levure Saccharomyces cerevisiae simplifier le clonage d’ADNc complets amplifiés par PCR ou pour réaliser en une seule étape la construction d’un vecteur navette ternaire levure-E. coli-A. tumefaciens et l’obtention d’un clone ADNc de l’ACLSV inoculable par agroinfiltration. Ces différentes stratégies devraient trouver une large application, en particulier pour tester plus rapidement des hypothèses d’étiologie pour les virus de plantes réputés "difficiles", tels que ceux infectant des hôtes ligneux.