Etude de la synthèse de l'ARN du virus de l'hépatite C in vitro et dans des cellules d’hépatocarcinomes

Abstract

La polymérase NS5B du virus de l’hépatite C (VHC) porte une activité ARN polymérase ARN-dépendante essentielle pour la réplication de l'ARN génomique viral. Cette réplication implique la synthèse d'un intermédiaire de réplication de polarité négative. In vitro et probablement in vivo, la NS5B initie la synthèse d'ARN par un mécanisme de novo qui nécessite des interactions spécifiques entre la polymérase virale et des éléments des ARN viraux. Dans une première partie nous avons étudié le rôle du GTP et d’un domaine C-terminal nommé linker de la polymérase. Nos résultats démontrent que des concentrations élevées de GTP sont nécessaires pour la transition de l'initiation à l'élongation de la synthèse de l'ARN. Des mutations dans le linker à la position 556 ne modifient pas la concentration de GTP nécessaire pour la transition. Toutefois, l'initiation de la synthèse d'ARN est augmentée par la mutation S556K. Une analyse structurale menée en parallèle suggère une implication directe du linker dans l'initiation de novo de la synthèse de l'ARN. Dans les deuxièmes et troisièmes parties, nous avons étudié le rôle de motifs ARN dans la traduction et la synthèse de l’'ARN du VHC. Nous avons démontré que la tige boucle SL-E1 formée par la région entre les nt 177 et 222 de l'extrémité 3' de l’ARN (-) est importante pour la synthèse d'ARN in vitro par la NS5B recombinante et dans les cellules Huh7 exprimant le complexe de réplication (RC) du VHC. SL-E1 est impliquée dans l’initiation de la synthèse d’ARN, au moins in vitro. Nous avons également étudié le rôle des tiges boucles SLV et SLVI du gène core. Nos données n'ont pas montré de rôle évident de ces séquences ou de leur complément dans la synthèse de l'ARN in vitro par la NS5B recombinante et en culture cellulaire par le RC du VHC. Nous avons confirmé leur effet négatif sur la traduction IRES dépendante par interaction ARN-ARN longue distance entre SL-VI et le 5'UTR et démontré que le miR122 ne peut pas empêcher cet interaction. Par contre, la présence de SL-VI prévient l’inhibition de la traduction induite par l’interaction entre le domaine III de l’IRES et la tige boucle 5BSL3.2 en 3’ du génome. Ces résultats démontrent la complexité des interactions ARN/ARN et ARN/protéines dans la régulation de la réplication virale.