Microscopie STED en champ large à l'aide de réseaux optiques et microscopie STED confocal à température cryogénique

Abstract

Les récents développements en microscopie super-résolue (PALM, STORM, RESOLFT, STED, ... ) ont permis d'atteindre des résolutions optiques nanométriques. Les premières méthodes (PALM, STORM, RESOLFT) sont dites de super-localisation. Elles nécessitent une densité faible de molécules émettant des photons afin de pouvoir pointer le centre de chacune d'entre elles indépendamment. Malgré une imagerie en champ large, ces techniques requièrent l'acquisition d'un nombre important d'images pour reconstruire une image super-résolue, ce qui limite fortement la cadence de génération des images. La microscopie STED est quant à elle une méthode d'imagerie confocale qui ne nécessite aucun post-traitement contrairement aux précédentes mais qui reste néanmoins lente par son type d'acquisition (enregistrement point par point). Pour accélérer cette cadence, nous avons parallélisé la méthode à l'aide de 100 points de mesure en utilisant un réseau optique pour l'excitation et la déplétion des fluorophores et d'une caméra CMOS pour la détection. Dans ces conditions, nous avons obtenues des images super-résolues (résolution de 70 nm) avec des billes fluorescentes de 20 nm de diamètre sur des champs de 3*3 μm2 et avons pu suivre la dynamique de diffusion de ces billes dans un gel de polymère à une cadence de 12.5 images/s. Nous avons également appliqué cette méthode à des échantillons biologiques (microtubules) . Dans une seconde partie, je montrerais qu'à température cryogénique, il est possible d'atteindre une résolution optique aussi petite que 5 nm pour des puissances optiques très modérées (seulement 100 μW). Cette nouvelle méthode permet d'envisager l'étude du couplage dipôle-dipôle en deux molécules organiques.