Microscopie par Localisation de Molécules Individuelles en Profondeur Utilisant la Technologie soSPIM et l'Optique Adaptative

Abstract

Les avancées des connaissances scientifiques sont souvent corrélées au développement de nouvelles techniques instrumentales. La biologie ne déroge pas la règle. Le développement récent des techniques de microscopie à fluorescence de super-résolution, récompensé par le prix Nobel de chimie en 2014, a révolutionné la façon d’observer les échantillons biologiques en permettant de dépasser la limite de résolution dictée par la diffraction de la lumière (~200 nm) et considérée jusqu’alors comme insurmontable. Parmi ces techniques, la microscopie par localisation de molécules individuelles (SMLM) permet d’imager l’organisation de protéines à l’intérieur des cellules avec les meilleures résolutions spatiales (~ 10 nm) et donne la possibilité de suivre leur dynamique au cours du temps. Ces nouvelles capacités ouvrent la voie à une meilleure compréhension de la machinerie cellulaire, essentielle pour mieux lutter contre ses dysfonctionnements, à l’origine de nombreuses maladies.La détection de molécules individuelles pour l’imagerie de super-résolution par SMLM est particulièrement difficile. Elle nécessite à la fois un sectionnement optique important et une grande efficacité dans la collecte du signal de fluorescence. En conséquence, elle est réalisée à l’aide de systèmes de microscopie spécialisés et dont la profondeur de pénétration dans les échantillons est extrêmement réduite. Le système de microscopie à feuille de lumière mono-objectif développé au sein de notre équipe, nommé soSPIM, permet de dépasser cette limitation. En combinant un sectionnement optique en profondeur avec l'utilisation d’un objectif à forte ouverture numérique, il permet la détection de molécules individuelles plusieurs dizaines de micromètres au-dessus d’une lamelle.L’imagerie de volumes entiers, tels que des cellules complètes, à ces profondeurs pose cependant d’autres défis. En excitation, la diffraction de la lumière impose un compromis important entre la finesse du sectionnement qu’il est possible de réaliser et le champ de vue. Pour tenter de dépasser cela, j’ai cherché à implémenter au système soSPIM une illumination par feuille de lumière non diffractive. En détection, les performances de l’imagerie par SMLM dépendent directement de la qualité optique du système. Or des défauts appelés aberrations optiques apparaissent systématiquement avec la profondeur d’imagerie. Pour corriger ces aberrations, j’ai implémenté un système d’optique adaptative au microscope soSPIM afin de permettre une localisation précise et en 3D de molécules individuelles en profondeur. Enfin, au-delà des défis optiques, les procédures d’acquisition et de reconstruction présentent elles-mêmes de nombreuses difficultés. J’ai donc mis en place plusieurs outils permettant de corriger les dérives spatiales, d’automatiser les acquisitions et de reconstruire les volumes imagés (~20x20x20 µm3) avec des résolutions nanométriques. Ces développements ont permis l’imagerie de cellules entières à 30 µm de profondeur avec des résolutions de 5 nm radialement (x,y) et 25 nm axialement (z). Ils forment ainsi une preuve de concept solide de la capacité du système soSPIM à l’imagerie par SMLM en profondeur. Ils ouvrent la voie à l’observation de nouvelles structures biologiques à des résolutions nanométriques jusqu’à présent inaccessibles.