Quantification des Brettanomyces par qPCR : Étude de la fiabilité, répétabilité et reproductibilité des kits

Abstract

Brettanomyces bruxellensis est une levure d’altération du vin avec de faibles besoins nutritionnels, résistante à l’éthanol et aux faibles pH, lui permettant une implantation en vin durant ou après la fermentation alcoolique (Conterno et al., 2006). B. bruxellensis est capable de produire des phénols volatils (éthyl-4-phénol, éthyl-4-gaïacol et éthyl-4-catéchol) (Oelofse et al., 2008). Ces molécules volatiles odorantes amènent un caractère phénolé et animal au vin connu sous le nom de « caractère Brett ». D’autres molécules (2-acétyltétrahydropyridine et 2-éthyltétrahydropyridine) produites par B. bruxellensis sont également responsables d’une déviation organoleptique appelée communément « goût de souris ». La détection et la quantification de cette levure sont donc nécessaires afin d’éviter l’altération du vin. L’isolement de cette levure sur milieu gélosé est utilisé en routine par les laboratoires spécialisés en œnologie. Cette méthode nécessite un temps d’incubation très long (> 7 jours) mais ne permet pas la quantification des cellules viables non cultivables. Des cultures en milieu liquide contenant les précurseurs des phénols volatils sont parfois effectuées afin de déterminer si les vins testés contiennent ou non B. bruxellensis. L’apparition de l’odeur « Brett » plus ou moins rapide permet d’avoir une estimation sur la quantité de cellules présentes. La cytométrie en flux est également un outil utilisé par les laboratoires afin de quantifier de manière spécifique B. bruxellensis : sonde spécifique fluorescente (Serpaggi et al., 2010), anticorps. En France comme à l’étranger, la principale méthode moléculaire utilisée est la PCR quantitative (qPCR). De nombreuses études portant sur cette dernière ont permis le développement de kits commerciaux afin de dénombrer spécifiquement B. bruxellensis dans le vin. Cependant, aucune étude n’a été effectuée sur la fiabilité, la répétabilité et la reproductibilité de ces kits. C’est pourquoi, dans cette étude, nous avons comparé les résultats obtenus en utilisant trois kits qPCR commerciaux permettant d’extraire l’ADN des cellules et de quantifier B. bruxellensis en vin rouge. Les analyses ont été effectuées par trois laboratoires sélectionnés, spécialisés en analyses œnologiques et sur trois vins rouges élaborés dans 3 régions différentes.