Caractérisation de l'organisation et du trafic de paires récepteur/anticorps thérapeutiques par microscopie de localisation de molécules uniques couplée au criblage à haut débit.

Abstract

L'immuno-oncologie est un domaine en pleine expansion, à la frontière de la thérapie du cancer. Les immunothérapies du cancer visent à stimuler le système immunitaire de l'organisme pour qu'il cible et attaque la tumeur, grâce à des anticorps thérapeutiques. Ces anticorps se lient spécifiquement aux récepteurs membranaires des cellules T, lymphocytes jouant un rôle central dans la réponse immunitaire, modifiant leur signalisation intracellulaire. Comprendre comment l'organisation spatiale des récepteurs et des protéines de signalisation est régulée, et comment elle détermine l'activation des lymphocytes, est devenu le "Saint Graal" de l'immunologie cellulaire. Dans cette optique, une meilleure compréhension des fonctions des anticorps et du trafic intracellulaire associé, permettrait d’expliciter les différences d’efficacité des candidats thérapeutiques ciblant les récepteurs d'intérêt. La microscopie de super-résolution permet l’accès à l'organisation et la dynamique des récepteurs membranaires avec des résolutions nanométrique. Elle offre la capacité de révéler des informations sur les évènements précoces déclenchés par la liaison d’un anticorps à son récepteur, permettant à terme l’optimisation de leur efficacité fonctionnelle. Associée aux techniques de criblage à haut débit, elle a le potentiel de jouer un rôle prépondérant dans les phases précoces des projets où il est nécessaire de sélectionner les meilleurs anticorps issus de banques pouvant en compter plusieurs centaines.L'objectif de cette thèse CIFRE a été de caractériser fonctionnellement l'organisation et le trafic de paires récepteur/anticorps par l’association de méthodes de microscopie super-résolution par localisation de molécules individuelles (SMLM) et de criblage à haut débit (HCS). Dans ce contexte, nous avons mis au point et utilisé une plateforme permettant de caractériser différents anticorps thérapeutiques ciblant des récepteurs de cellules T, dans le but de recueillir des informations quantitatives sur les candidats thérapeutiques potentiels. Nous avons également optimisé la technique d'imagerie à feuille de lumière simple objectif (soSPIM) dans le but de pouvoir réaliser une cartographie 3D des récepteurs membranaires sur d'une cellule T entière avec une résolution nanométrique. Cette nouvelle approche permet l'imagerie de cellules T dans des conditions plus physiologiques, fournissant des informations complémentaires par rapport aux expériences de criblage à grande échelle. Ces deux techniques nous ont permis d’améliorer notre compréhension du mode d'action des anticorps sur les récepteurs au niveau de la cellule unique. Les expériences à grande échelle réalisées dans le cadre de ce travail ont nécessité plusieurs développements logiciels pour l'automatisation de l'acquisition et l'analyse statistique des Téraoctets de données de molécules individuelles générées. Ce projet de thèse s'est concentré sur la cible PD-1, un point de contrôle crucial du système immunitaire impliqué dans la modulation de l'activation des lymphocytes. La première partie de la thèse a été principalement consacrée à la mise en place de nouveaux protocoles pour l'imagerie de super-résolution des récepteurs PD-1 sur cellules Jurkat activées. La seconde partie concerne l’étude de l'impact d’anticorps thérapeutiques anti-PD-1 utilisés en routine en clinique, sur l'organisation spatiale et la dynamique des récepteurs PD-1 sur cellules vivantes, à l’échelle nanométrique. Ce travail est la preuve concept de l’utilité de ces outils d’imagerie de pointe pour la caractérisation quantitative d’anticorps monoclonaux thérapeutiques ciblant PD-1 à la membrane des cellules T.