La pompe à efflux multidrogue de type MFS à trois composants EmrAB-TolC d’Escherichia coli : du clonage à l’analyse structurale

Abstract

A l’heure actuelle, suite à une mauvaise utilisation des antibiotiques, nous faisons face à un problème majeur de santé publique. En effet la résistance aux antibiotiques de certaines souches bactériennes rend le traitement des infections très complexe. Dans ce contexte, le présent projet de thèse concerne l'étude d'un complexe d'efflux bactérien capable de transporter des antibiotiques du cytoplasme vers l'extérieur de la cellule. Ce complexe est composé d'un transporteur de la membrane interne appartenant à la Major Facilitator Superfamily (MFS) (EmrB, E. coli multidrug resistance), d'un canal de la membrane externe TolC (Tolerance to Colicin E1) et d'un adaptateur périplasmique (EmrA, E. coli multidrug resistance). Contrairement aux systèmes d'efflux de type RND (tels que AcrAB-TolC), peu de choses sont connues sur le système EmrAB-TolC de type MFS. Il est donc important d'étudier l'ensemble du complexe sur le plan structurale et fonctionnel afin d'identifier les différences entre ces deux types de systèmes d’efflux. L'objectif de mon projet de thèse était d'étudier au moins un complexe EmrAB-TolC d'un point de vue structurale. Ainsi durant mes études, le but était d'isoler le complexe directement des bactéries surexprimant les trois partenaires protéiques. Dans un premier temps, 15 systèmes homologues EmrAB-TolC ont été identifiés et leurs gènes correspondants amplifiés à partir de l'ADN génomique de différentes bactéries à Gram négatif. Parmi les gènes des 15 systèmes, les gènes codant pour les systèmes d’E. coli et de V. cholerae ont été étudiés plus en détail. Les vecteurs d'expression codaient pour des marqueurs fluorescents pour la mesure des niveaux d'expression de différentes protéines et pour l'étude de la formation des complexes. Dans un premier temps, les différents niveaux d'expression des protéines (EmrB-mRFP1 et EmrA-sfGFP) ont été étudiés pour plusieurs souches d'expression d'E. coli en mesurant les niveaux de fluorescence rouge et verte et par Western blot (anti-His, Myc et Strep pour EmrB, EmrA et TolC). La souche d'E. coli C41(DE3) était la mieux adaptée pour la co-expression d’EmrAB-TolC. Dans un deuxième temps, la méthodologie FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) a été utilisée pour identifier un complexe adapté à l'étude structurale. Ainsi, cette méthode a permis d'observer que le complexe EmrAB-TolC d'E. coli était produit en plus grande quantité que celui de V. cholerae. Le protocole final de co-purification consiste à effectuer une lyse douce des bactéries à l'aide du lysozyme, puis après solubilisation avec le DDM, la purification est débutée par une étape de chromatographie d'affinité Ni2+-NTA suivie d'une étape de chromatographie d'exclusion stérique. Enfin, les fractions contenant les trois partenaires protéiques sont utilisées pour l'échange de détergent par l'amphipol A8-35 avant l'étude structurale par microscopie électronique. Les images de microscopie électronique en coloration négative montrent des objets allongés d'une longueur de 33 nm en vue de côté. Une image moyenne d'EmrAB-TolC montre des similitudes avec celle du complexe AcrAB-TolC observé dans des conditions similaires. Les similitudes concernent les densités caractéristiques de TolC. Des différences ont été trouvées pour la partie inférieure d'EmrAB qui est plus fine que la partie inférieure d'AcrAB. Les densités visibles au-dessus de l'anneau d'amphipol correspondent à EmrA, qui présente une structure en forme de canal comme observé avec AcrA. Le canal semble cependant s'étendre plus loin vers la ceinture d'amphipol. Comme EmrB n'a pas de domaine périplasmique étendu présent dans le cas des protéines RND, ces densités sont donc uniquement attribuées à EmrA. EmrA, de l'autre côté, contacte TolC de manière similaire à l'interaction d'AcrA/MexA avec leurs canaux de la membrane externe respectifs (TolC/OprM) de façon «tip-to-tip».