Clonage, ingénierie et transfert de grands fragments de génome chez Bacillus subtilis

Abstract

L’ingénierie des génomes des micro-organismes est devenue un standard dans les biotechnologies microbiennes. En 2010, des technologies prometteuses de biologie de synthèse utilisant la levure comme plateforme pour l’assemblage et l’ingénierie de génomes synthétiques bactériens suivi de leur transplantation dans une cellule receveuse ont vu le jour. Ces technologies ont conduit à la création des premières cellules synthétiques et ouvert de nouvelles voies vers la construction de cellules aux propriétés biologiques entièrement contrôlées. Le transfert de ces outils à des micro-organismes d’intérêt industriel comme la bactérie Gram+ Bacillus subtilis (Bsu), modèle dans le secteur des biotechnologies, constituerait une avancée majeure. C’est précisément l’objectif du projet ANR « Bacillus 2.0 », qui réunit deux équipes INRAE et qui se propose d’adapter l’ensemble de ces outils de biologie de synthèse à Bsu afin d’être en mesure de partir d’une conception, assistée par ordinateur, de génomes semi-synthétiques de Bsu jusqu’à l’obtention de nouvelles souches industrielles. Cependant, les premiers travaux réalisés sur ce projet ont montré que le génome entier de Bsu ne pouvait pas être cloné et maintenu en l’état dans la levure. Ces résultats risquaient de remettre en question la faisabilité du projet dans son ensemble et en particulier la pertinence d’utiliser la levure comme plateforme d’assemblage du génome semi-synthétique de Bsu.L’objectif de ma thèse a consisté à démontrer que la levure restait un hôte pertinent pour le projet « Bacillus 2.0 ». Elle s’est déclinée en 3 parties. Dans la première partie, une méthode de clonage de génome récemment développée au laboratoire et dénommée CReasPy-Fusion, a progressivement été adaptée à Bsu. Les résultats obtenus ont montré (i) le transfert possible d'ADN plasmidique entre protoplastes bactériens et sphéroplastes de levure, (ii) l'efficacité d'un système CRISPR-Cas9 porté par les cellules de levure pour capturer/modifier cet ADN plasmidique pendant la fusion Bsu/levure, puis (iii) l'efficacité de ce même système pour capturer des fragments de génome d’une centaine de kb à partir de trois souches différentes. Des observations en microscopie à fluorescence ont également été réalisées et ont mis en évidence deux types d’interactions qui permettraient de passer d’un contact protoplastes/sphéroplastes à un ADN bactérien cloné dans la levure. Dans la seconde partie de ma thèse, la méthode CReasPy-Fusion a été mise à profit pour tenter de cloner de grands fragments du génome de Bsu dans la levure. Des fragments génomiques jusqu’à ~1 Mb ont pu être clonés dans la levure, mais leur capture a nécessité l’ajout préalable d’un grand nombre d’ARS sur le génome de Bsu pour stabiliser les constructions génétiques. La dernière partie a été l’adaptation de la méthode RAGE à Bsu. Cette méthode permet le transfert, non pas d’un génome entier mais de portions de génomes bactériens depuis la levure vers la bactérie à éditer. Une preuve de concept a été réalisée avec l’échange d’un premier fragment de génome de 155 kb par une version réduite de 44 kb.En conclusion, les travaux réalisés au cours de cette thèse ont montré la pertinence d’utiliser la levure comme plateforme d’ingénierie dans les modifications à grande échelle du génome de Bsu. D’une part, nous avons montré que des fragments d’une centaine de kb peuvent être clonés dans la levure, modifiés et transférés dans une cellule receveuse de façon à générer des Bsu mutants. Cette stratégie offre une véritable alternative à la transplantation de génome. D’autre part, nous avons montré que de grands fragments du génome de Bsu (jusqu’à 1Mb) peuvent également être clonés dans la levure à condition de contenir de nombreux ARS dans leurs séquences. Grâce à ces résultats, le clonage d’un génome réduit de Bsu chez la levure est redevenu un objectif réalisable.