Optimisation de la préparation des greffons hématopoïétiques pourla thérapie cellulaire : Effets combinés de l'acide alpha lipoïque et de l’inhibition de la voiec-Jun N-Terminal kinase sur les processus d'amplification et de différenciation ex vivodes cellules souches hématopoïétiques

Abstract

Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) sont des cellules très primitives à l’origine de toutes les cellules sanguines matures nécessaires à l’homéostasie de l’organisme par des fonctions immunitaires, de transport d’oxygène et d’hémostase. Les CSHs sont caractérisées par leurs capacités d’autorenouvèlement et de multipotence qui leur permettent de maintenir un pool de cellules indifférenciées tout au long de la vie assurant les besoins en cellules matures. Ces deux caractéristiques sont également essentielles dans le cadre de traitements par thérapie cellulaire de certaines hémopathies (leucémies) et nécessitant l’infusion de greffons hématopoïétiques. La composition de ces greffons est alors très importante, et doit comprendre, une grande quantité de cellules dites « progénitrices » qui vont se différencier rapidement et assurer la survie du patient à court-terme, et un nombre suffisant de CSH pour régénérer une hématopoïèse efficace et durable pour assurer la survie du patient à long-terme. Dans certains cas, afin d’assurer une quantité suffisante de cellules progénitrices, le greffon doit subir une étape d’expansion ex vivo qui présente cependant l’inconvénient majeur de la perte des CSH par différenciation au cours de leur division en culture. Conceptuellement, les CSHs peuvent s’auto-renouveler selon deux modes différents : le mode asymétrique qui va initier la génération d’une cellule souche et d’une cellule progénitrice plus différenciée, et le mode symétrique qui va permettre la génération de deux cellules souches filles fonctionnellement identiques à la cellule mère. L’étude et la compréhension de ces deux mécanismes sont essentielles pour les connaissances en recherche fondamentale, mais aussi dans le contexte de l’expansion des greffons ex vivo. C’est pourquoi les travaux réalisés lors cette thèse ont eu pour but d’optimiser les protocoles d’expansions ex vivo grâce à l’utilisation de molécules montrées comme efficaces dans le maintien et l’amplification des CSHs et d’analyser la population enrichie en CSHs obtenue, par une étude transcriptomique en single cell. Ces différentes analyses ont servi à mettre en lumière les mécanismes, liés à l’autorenouvèlement et au maintien des capacités souches, mis en jeux lors de l’amplification ex vivo des cellules primitives. Concernant la première partie, nous avons montré que l’addition d’un inhibiteur de la C-Jun N-terminal Kinase (le JNK-IN-8 = IN8) et d’une molécule anti-oxydante (L’acide alpha lipoïque = ALA) au milieu de culture pendant 12 jours, permettait une expansion 5 fois supérieurs des cellules primitives (caractérisées par la présence de l’antigène membranaire CD34) comparativement aux cultures contrôles. De plus, le pool de cellules CD34+ générées en présence de la combinaison IN8+ALA, permettait une augmentation significative de la greffe et de la reconstitution hématopoïétique humaine dans des souris immunodéficientes 16 semaines après la transplantation. Ces résultats nous ont permis d’émettre l’hypothèse que la combinaison IN8+ALA amplifiait le nombre de CSHs pendant la phase d’expansion, potentiellement en favorisant l’autorenouvèlement par division symétrique. La deuxième partie de ces travaux s’est concentrée sur l’étude des mécanismes et des voies de signalisation régulés pendant l’amplification des cellules CD34+ en présence de IN8 et/ ou ALA. Nous avons donc réalisé une étude approfondie du transcriptome des cellules CD34+ : fraichement isolées, après 6 heures de culture avec ou sans les différentes molécules seules et en combinaison, ainsi qu’au bout des 12 jours de culture en présence de la combinaison IN8+ALA. Les résultats ont montré une augmentation de l’expression des gènes liés au dynamisme et au maintien de l’intégrité du cytosquelette, une diminution des gènes liés à la différenciation ainsi qu’une augmentation des gènes liés au maintien des capacité souches, notamment par l’activation de la voie WNT/β-catenin connue pour ces effets.