Caractérisation biophysique des complexes ARN-ligands par spectrométrie de masse native

Abstract

Les aptamères sont des acides nucléiques capables de se lier sélectivement à un ligand ou à une famille de molécules. Les aptamères sont la partie sensible des riboswitches, qui sont des segments régulateurs de l'ARN messager impliqués dans l'expression génétique. Les aptamères ont aussi des applications prometteuses comme sondes artificielles et capteurs Pour ces technologies, il est crucial de comprendre comment la liaison se produit, de la quantifier, et de comprendre comment les changements conformationnels sont induits par les ligands. Les objectifs de cette thèse sont d'explorer l'applicabilité de la spectrometrie de mobilité ionique (IMS) couplée à la spectrométrie de masse (SM) native aux aptamères d'ADN et d'ARN, d'abord dans la quantification de liaison, ensuite dans la détection du changement conformationnel lors de la liaison du ligand.Dans la première partie, nous avons évalué la détermination des valeurs de constantes d’équilibre de dissociation (KD) par MS, en tenant compte des facteurs de réponse relatifs (Rx) des aptamères libres et liés. Les titrages en SM sont comparés, pour validation, avec la calorimétrie par titrage isotherme (ITC). Deux aptamères d'ARN sont pris comme modèles : l'aptamère du vert de malachite, largement étudié par ITC, et l'aptamère de la riboflavine mononucléotide , un cas réaliste d'ARN Mg2+-dépendant pour la liaison du ligand. Nous avons observé que l'acétate d'ammonium et l'acétate de triméthyl ammonium conviennent à l'étude des aptamères et leurs complexes, et que les valeurs de KD obtenues par ITC et SM native sont comparables. Les aptamères ARN de la néomycine et de la tobramycine ont été choisis pour tester la limite de détection en SM native. Nous concluons que la SM native est adaptée pour déterminer des valeurs de KD comprises entre 50 nM et 30 µM. La correction apportée par Rx est relativement modeste dans tous les cas, en suggerant que la liaison du ligand n'est pas associée à une différence conformationnelle significative lors de l'ionisation. Pour ces aptamères, nous concluons que l'hypothèse de Rx égaux est acceptable.Dans la deuxième partie, nous avons évalué si le mécanisme de "liaison adaptative" des aptamères peut être révélé par IMS. À cette fin, en plus des systèmes énumérés ci-dessus, nous avons étudié l'aptamère ARN de la tétracycline et une série d'aptamères ADN capables de lier la cocaïne, pour lesquels le changement conformationnel par liaison du ligand est largement documenté dans la littérature. Pour tous les aptamères à l'exception de l'aptamère de la tétracycline, nous n'avons pas observé de différences significatives dans la conformation en phase gazeuse des ions liés aux ligands ou Mg2+. Cependant, nous avons observé un changement significatif dans la mobilité des ions de l'aptamère de la tétracycline. Le Mg2+ (100 µM) s’avère essentiel pour la liaison du ligand. Pour la série des aptamères de la cocaïne, même si nous ayons observé dans des conditions douces de pré IMS des ions compacts aussi bien pour les aptamères libres que pour les aptamères liés, une extension conformationnelle est visible à haute activation pre-IMS, bien révélée par l'état de charge 7-, qui suggère des réarrangements de phase gazeuse. Pour mieux étudier ces réarrangements, nous avons modifié les séquences avec des extensions dA, afin de comparer des systèmes ayant un nombre similaire de degrés de liberté sans modifier la structure cœur. Nous proposons également de nouvelles façons de présenter ces données, mieux adaptées quand la dissociation du ligand, la perte d’aduits et le dépliement d’ion arrivent dans les mêmes gammes d’énergie. L'augmentation graduelle de l'activation collisionnelle avant l'IMS, a révélé que l’energie de dépliement est corrélée au contenu en paires de bases, ce qui suggère que les paires de bases sont conservées dans les structures en phase gazeuse. Nous avons également observé que le ligand se perd à des énergies inférieures à celles du dépliage.