Développement d’un microréacteur biomimétique pour l'analyse in situ d'activités enzymatiques par couplage de l’électrochimie et de la microscopie de fluorescence

Abstract

De nombreuses réactions enzymatiques sont à l’origine de processus physiologiques au sein des organismes vivants. Ces réactions sont basées sur des transferts de protons et d’électrons et con-duisent souvent à la production d’espèces secondaires. Parmi elles, les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS, RNS) présentent un intérêt particulier puisqu’elles jouent un double rôle : d’une part en permettant à l’organisme de réagir à un stress par l’activation de voie de signalisation redox, et d’autre part ces ROS et RNS peuvent causer des dommages tissulaires et être à l’origine de dys-fonctionnement (stress oxydant) au sein de l’organisme. La haute réactivité de ces espèces induit leurs faibles durées de vie (ns-min) et rend l’étude de certaines réactions enzymatiques difficiles en solu-tion. Ce projet de thèse a pour objectif de développer un microréacteur biomimétique pour l’étude d’activités enzymatiques produisant des ROS/RNS. En effet, en confinant une réaction au sein d’un compartiment de taille équivalente à celle d’une cellule (20-100 μm de diamètre), les espèces générées (H2O2, NO•, NO2-) doivent pouvoir être sondées in situ avec une résolution cinétique et quantitative. Des vésicules unilamellaires géantes sont formées en conditions physiologiques et servent de micro-réacteurs pour l’analyse des activités enzymatiques de la glucose oxydase et des NO-synthases. La microscopie de fluorescence permet l’observation des vésicules et le suivi du déclenchement de la réaction assuré par microinjection. Les espèces produites sont ensuite détectées en temps réel par électrochimie afin de déchiffrer à terme les différentes voies enzymatiques des NO-Synthases.