Caractérisation structurale des fibrilles amyloïdes par RMN à l'état solide

Abstract

Projet 1- Dissection structurelle de fibrilles amyloïdes de différentes constructions TDP-43 par RMN à l'état solide. La protéine de liaison à l'ADN TAR de 43 kDa (TDP-43) est observée comme le principal composant des inclusions cytoplasmiques des cellules de patients souffrants de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de la démence lobaire frontotemporale (DLF). La protéine TDP-43 se compose d'un domaine N-terminal (NTD) possédant une structure définie, de deux domaines de motifs de reconnaissance de l'ARN (RRM1 et RRM2) et d'un domaine C-terminal intrinsèquement désordonné (CTD). Le domaine C-terminal de type prion contient la plupart des mutations pathologiques pertinentes aujourd’hui connues et joue un rôle essentiel dans l'agrégation spontanée de TDP-43 et de la pathologie associée. Nous avons utilisé une combinaison de microscopie électronique, de diffraction des rayons X, d'analyse par spectroscopie infrarouge (par Transformée de Fourier) et de spectroscopie RMN des solides pour étudier l'organisation moléculaire de différents fragments de TDP, à savoir le TDP-43 complet, deux fragments C-terminaux (TDP-35 et TDP-16) et un fragment C-terminal tronqué (TDP-43 ∆GaroS2) dans leur état fibrillaire. Bien que les différentes constructions protéiques présentent une morphologie fibrillaire similaire et une signature typique de cross-β par diffraction des rayons X, les expériences de RMN des solides indiquent que TDP-43 et TDP-35 partagent la même structure moléculaire polymorphe. En même temps, la protéine tronquée TDP-16 comprend un noyau amyloïde bien ordonné. Nos résultats démontrent que les fragments C-terminaux peuvent adopter une conformation moléculaire différente, indépendamment ou dans le contexte de l'assemblage complet, ce qui suggère que les domaines N-terminaux et RRM jouent un rôle essentiel dans la transition amyloïde de la protéine TDP-43. Les études par RMN des solides des isoformes TDP-43 (sTDP43-1, sTDP43-2) responsables des sous-types de la SLA démontrent que ces isoformes peuvent former des amyloïdes sans le CTD et adopter un pli amyloïde similaire à TDP-43 complet, suggérant un mécanisme de repliage non-correct des domaines NTD et RRM responsables de la transition amyloïde dans les isoformes TDP43.Projet 2- Mécanisme moléculaire des protéines de signalisation amyloïdes hétérotypiques NWD2/HET-s impliquées dans la mort cellulaire programmée chez les champignonsLe prion [Het-s] active la protéine HET-S formant des pores et déclenchant la mort cellulaire programmée (PCD) chez le champignon Podospora anserina. La structure de type solénoïde de HET-s sert de modèle pour la transition amyloïde du domaine de formation du prion HET-S (PFD). Une protéine de la famille des récepteurs de type Nod-like (NLR) appelée NWD2, codée par le gène voisin de het-S, possède un motif N-terminal (R0) homologue à l'unité répétitive élémentaire de la structure b-solénoïde de HET-s (R1, R2). Les NLR sont associés à la défense de l'hôte et à la mort cellulaire programmée chez les plantes, les animaux et les champignons. Lors de l'activation, le motif N-terminal (R0) peut adopter la conformation solénoïde, servir de modèle à la transition amyloïde du domaine HET-S formant le prion, et déclencher la voie de mort cellulaire en aval. Dans ce travail, nous avons déduit la structure à résolution atomique adoptée par l'amyloïde fonctionnelle NWD2 (R0) en utilisant la RMN des solides. Nous avons également montré que le mécanisme de modélisation impliquant NWD2 et HET-S est obtenu par la formation d'une interface amyloïde hétérotypique via R0/R2, suivie par la PCD.