Modèles et méthodes expérimentales pour la caractérisation in situ de la dynamique d'enzimes immobilisés

Abstract

Le travail présenté ici porte sur une approche théorique et expérimentale du comportement d’une monocouche peu dense d’enzymes, accrochés à un support solide. Les enzymes forment une classe de protéines, macromolécules biologiques, dont le rôle est de catalyser les réactions chimiques nécessaires au fonctionnement des cellules. Leur accrochage à une surface les contraint fortement et permet de se rapprocher de conditions plus réalistes qu’avec un enzyme en solution diluée. Nous voulons donc caractériser la réponse de ces couches en présence des substrats (réactifs de la réaction à catalyser). L’approche théorique nous permet, au moyen de simulations numériques, de modéliser les effets de la localisation spatiale et de la charge de la surface solide sur la dynamique enzymatique de la monocouche accrochée. Les résultats de ces simulations sont comparés aux mesures d’activité par absorbance, réalisées sur les monocouches de l’enzyme phosphoglycérate kinase (PGK) de levure dont les constantes caractéristiques fournissent les valeurs numériques des calculs. La résonance de plasmons de surface (SPR) est une technique optique sensible à des variations d’indice près d’une surface métallique. Les expériences réalisées présentent des caractéristiques liées à la présence de la PGK (amplitude du bruit, influence du pH de la solution utilisée). D’autre part, plusieurs arguments tendent à montrer que ces mesures SPR portent la signature de la spécificité des enzymes pour leur(s) substrat(s). Des mesures complémentaires de microscopie de force atomique (AFM) et d’absorbance permettent de quantifier le taux de couverture de la surface et le nombre d’enzymes actifs après accrochage. Nous validons de cette façon le protocole mis au point qui permet la formation d’une monocouche peu dense et n’annihile pas l’activité enzymatique, nécessaire à une mesure SPR sensible à la spécificité des interactions enzymes-substrats.