Adressage d’un gène à une tumeur via des cellules sanguines circulantes : contrôle de l’expression par hyperthermie locale et suivi par imagerie

Abstract

Les thérapies géniques et cellulaires ouvrent de nouvelles perspectives pour le traitement de pathologies très diverses. Cependant, l’adressage à un organe cible, le contrôle non invasif de l’expression d’un transgène et le suivi par imagerie constituent encore des défis majeurs pour le développement de ces approches thérapeutiques. L’utilisation d’un vecteur cellulaire modifié génétiquement pour exprimer un transgène spécifique semble une solution prometteuse mais il convient aussi de restreindre l’expression du transgène à la région cible et de contrôler l’expression génique dans le temps. Pour le contrôle spatio temporel de l’expression, nous proposons une approche in vivo originale qui consiste à placer le gène thérapeutique sous le contrôle d’un promoteur thermo-inductible et à contrôler l’expression par une hyperthermie localisée induite à l’aide d’Ultrasons Focalisés guidés par Imagerie de Résonance Magnétique (IRM) de température (MRgHIFU).La stratégie expérimentale consiste à générer une souris chimère par greffe de moelle osseuse. La souris donneuse est une souris transgénique qui exprime le gène rapporteur bioluminescent de la luciférase Firefly (lucF) et le gène rapporteur fluorescent de la protéine mPlum sous le contrôle du promoteur thermosensible Hsp70a1b. La souris receveuse est une souris congénique prétraitée au Busilvex® pour créer une aplasie médullaire. Deux mois après, le pourcentage de greffe est déterminé par cytométrie de flux puis une tumeur sous-cutanée est induite sur la patte arrière gauche des souris par injection sous-cutanée de cellules tumorales (Carcinoma Mouse Tumor: CMT-93). Pendant la période de croissance tumorale (1 mois) les processus physiologiques conduisent au recrutement des cellules sanguines circulantes dans la zone péri-tumorale sans expression des transgènes. L’activation du promoteur Hsp70 est alors réalisée en créant une hyperthermie locale par MRgHIFU. L’IRM permet d’obtenir des cartes thermiques utilisées pour asservir un générateur d’ultrasons et pour contrôler le chauffage (45°C, 8 min, +/- 1°C). L’expression de la lucF est détectée in vivo 6 H après chauffage par imagerie de bioluminescence (BLI) alors que l’expression de la protéine mPlum est révélée 30 H après chauffage par imagerie de fluorescence par réflectance (FRI). A la suite de l’imagerie, les souris sont sacrifiées et une analyse histologique de la tumeur et des tissus périphériques est réalisée grâce à l’expression de la protéine mPlum. Les gènes rapporteurs lucF et mPlum sont exprimés après thermo-induction principalement par les macrophages de la souris chimère et l’expression intervient, comme attendu, dans les zones péri-tumorales chauffées. Parfois, l’expression des gènes rapporteurs est détectée dans des zones non ciblées et résulte de l’expression par les progéniteurs myéloïdes situés au niveau de la moelle osseuse en réponse à l’échauffement des os par les ultrasons.Nous avons ainsi pu démontrer in vivo la faisabilité de l’approche thérapeutique proposée et mis en évidence certaines limites de la procédure expérimentale essentiellement inhérentes à la taille du modèle animal et aux méthodes physiques utilisées pour l’activation in vivo du transgène.Nous proposons également une stratégie in vivo afin d’évaluer les performances de la tomographie moléculaire de fluorescence 3D pour suivre in vivo, le devenir d’une nano-émulsions fluorescentes (LNP) chez des souris porteuses de tumeurs intracrâniennes.