Identification et validation de nouveaux gènes candidats impliqués dans la régulation du développement du fruit de tomate

Abstract

La tomate (Solanum lycopersicum) est l’espèce modèle pour l’étude du développement des fruits charnus. Il a notamment été montré que la signalisation hormonale était un élément central d’un réseau complexe de régulations gouvernant ce processus. Le but de ce travail de thèse était de réaliser la validation fonctionnelle de nouveaux gènes candidats potentiellement impliqués dans la régulation du développement du fruit. Pour cela, le travail s’est découpé autour de trois axes : 1) la validation de l’utilisation de quatre promoteurs de tomate et d’un promoteur d’Arabidopsis thaliana dans des constructions permettant la surexpression ou le silencing de gènes dans le fruit de tomate, à des phases particulières de son développement ou dans des tissus spécifiques du fruit, 2) l’analyse fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à F-Box chez la tomate et 3) l’analyse fonctionnelle du gène SlGEM1.Le premier axe de ce travail a porté sur la caractérisation des promoteurs des gènes de tomate IMA (INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY), TPRP (TOMATO PROLIN-RICH PROTEIN), PPC2 (PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE 2) et PG (POLYGALACTURONASE), ainsi que du promoteur du gène CRC (CRABS-CLAW) d’Arabidopsis thaliana. Des plantes transgéniques ont été générées permettant d’exprimer, sous le contrôle de ces différents promoteurs, le gène rapporteur GUS seul ou fusionné à la GFP (Green fluorescent protein) et à un signal d’adressage au noyau (NLS). L’étude de ces plantes a permis de mettre en évidence la spécificité spatio-temporelle de l’expression de ces différents promoteurs lors du développement du fruit. Dans le cas du promoteur LePPC2, la fusion transcriptionnelle avec la GFP et un signal NLS a permis de montrer une activité spécifique dans les cellules du péricarpe des fruits de tomate en phase d’expansion cellulaire. Cette partie du travail de thèse a validé l’utilisation de ces différents promoteurs pour de futures analyses fonctionnelles de gènes régulateurs du développement du fruit chez la tomate.Le deuxième axe de ce travail a porté sur l’identification de protéines à F-Box impliquées dans la régulation du développement du fruit chez la tomate. En effet, il a été montré que ces protéines à F-Box jouent un rôle particulièrement important dans les processus de régulation chez les plantes grâce à leur fonction de reconnaissance de protéines régulatrices cibles par les complexes SCF (SKP1-Cullin-F-Box), qui sont alors marquées par ubiquitinylation, pour leur dégradation par le protéasome 26S. Parmi les 95 séquences de protéines à F-Box disponibles dans les bases de données d’EST au début de ce travail, quatre gènes candidats ont été retenus pour leur expression tissu-spécifique lors du développement précoce du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) ont été générées pour chacun de ces gènes candidats et leur analyse préliminaire a permis de proposer un rôle dans le développement chez la tomate pour une d’entre elles.Le troisième axe de ce travail a porté sur la caractérisation fonctionnelle du gène SlGEM1, l’orthologue du gène AtGEM (GLABRA2-EXPRESSION MODULATOR), dont le niveau d’expression semblait corrélé à la taille des cellules dans le fruit de tomate. En effet, les données disponibles sur AtGEM montrant son implication dans la coordination de la prolifération et la différenciation des cellules en faisaient un candidat intéressant au contrôle de la taille et du développement du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) SlGEM1 ont été générées, et des mutants de ce gène ont été identifiés par TILLING dans la banque de mutants EMS de la variété Microtom de tomate disponible au laboratoire. Le phénotypage de ces plantes a permis de mettre en évidence une potentielle implication de SlGEM1 dans le développement des fleurs et dans la fertilité des grains de pollen.