Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans l'assemblage des systèmes d'efflux tripartites RND participant à la résistance aux antibiotiques chez Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Face à la menace croissante de l’antibiorésistance, il est urgent de mieux connaître ses mécanismes afin de trouver des solutions pour combattre mais aussi limiter l’apparition des souches multirésistantes. Dans ce contexte, le sujet de la thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires de l’efflux actif de drogues chez Pseudomonas aeruginosa, l’un des plus importants mécanismes utilisés par la bactérie pour lutter contre l’action d’un grand nombre d’antibiotiques. Les systèmes d’efflux forment des complexes protéiques situés dans la paroi de la bactérie capables d’expulser de manière active une grande variété de composés, dont les antibiotiques, avant même qu’ils aient pu atteindre leur cible intracellulaire, les rendant ainsi inactifs.Chez les bactéries à Gram négatif, les systèmes d'efflux tripartites partagent une architecture structurelle similaire, composée d'un transporteur inséré dans la membrane interne et d'un canal traversant la membrane externe, pontés par une protéine adaptateur périplasmique. Les trois partenaires forment ainsi un conduit étanche traversant le périplasme, permettant d’expulser l’antibiotique à l’extérieur de la bactérie grâce à l'utilisation d’un gradient de proton.L’objectif de la thèse a été de développer des études structurales et biophysiques pour mieux comprendre le mécanisme d’assemblage du complexe tripartite MexA-MexB-OprM, prototypique des systèmes d’efflux tripartites de la famille des RND (Resistance Nodulation cell Division). La stratégie a consisté à analyser les interactions bipartites par des méthodes biophysiques (BioLayer Interferometry, Flow Induced Diffusion Analysis) et de déterminer la structure des complexes tripartites par microscopie électronique en coloration négative, en incluant des protéines tronquées ou comportant des mutations ponctuelles.Des déterminants structuraux pour l’adaptateur MexA ont été identifiés, permettant d’étendre son interaction à d’autres protéines canal qu’OprM. L’implication dans le mécanisme d’assemblage d’une mutation ponctuelle de MexA (Q93R), présente dans la couronne de six hélices décrite dans la structure cryo-ME du complexe tripartite et située proche d’OprM, a été analysée. Cette mutation n’est pas impliquée directement dans les contacts de nature « tip-to-tip » avec OprM, pourtant elle conduit à un meilleur rendement de formation de complexes tripartites MexA-MexB-OprM, mais aussi à la formation de complexes hybrides avec OprN et TolC, homologues d’OprM chez P. aeruginosa et E. coli, révélant ainsi un gain de résistance des bactéries aux antibiotiques. Une analyse de l’énergie d’hexamérisation de MexA montre que cette mutation favorise la formation de l’hexamère de MexA.Par ailleurs un déterminant structural pour OprM, également non impliqué dans les contacts « tip-to-tip » avec MexA, a été montré comme indispensable pour la formation du complexe tripartite. En effet, la délétion d’un fragment en position C-terminale a un impact négatif sur l’interaction de MexA avec OprM. De manière intéressante, MexAQ93R permet de restaurer la formation d’un complexe tripartite.Ces nouveaux déterminants structuraux mis en évidence pour l’interaction MexA-OprM et contrôlant la formation du complexe tripartite, constituent des éléments clés régissant l’assemblage, en plus de ceux décrits dans les contacts « tip-to-tip », et apportent un nouvel éclairage sur la séquence d’assemblage du complexe tripartite. L’identification de ces déterminants pourrait être capitale dans le cadre de recherches pharmaceutiques vouées à répondre à la résistance aux antibiotiques des bactéries pathogènes.