De la biogénèse à l'organisation synaptique : mise au point d'outils pour étudier les protéines auxiliaires des AMPAR

Abstract

Dans le système nerveux central, la transmission synaptique excitatrice rapide est principalement médiée par les récepteurs de l'acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPAR). Les AMPAR sont des récepteurs homo ou hétéro tétramériques assemblés à partir de combinaisons de quatre sous-unités, GluA1-4 qui forment un pore. Celui-ci s’assemble en un complexe macromoléculaire avec plusieurs protéines structurellement non apparentées, les protéines auxiliaires des AMPAR. Plus de 30 protéines auxiliaires différentes ont été identifiées. Celles-ci exercent un large éventail de fonctions sur le récepteur : stabilisation, exportation du réticulum endoplasmique (ER), trafic, ancrage synaptique, modulation du canal. Malgré leur importance pour le bon fonctionnement des récepteurs et, par conséquent, pour la transmission synaptique, leurs fonctions restent mal connues. Le principal facteur limitant a été le manque d'outils, soit pour visualiser directement la protéine cible sans compromettre sa fonction, soit pour étudier directement la dynamique de son interaction avec le récepteur dans des cellules vivantes.La protéine ferric-chelate reductase 1-like (FRRS1l) a été désignée comme un acteur clé au cours des premières étapes de la biogenèse des AMPAR, mais les mécanismes à l'origine de ce rôle putatif étaient inconnus. Récemment, il a été montré que FRRS1l, parmi d'autres protéines interagissant avec l’ER, participe aux différentes étapes de l'assemblage des AMPAR. Cependant, la dynamique de ce processus est inconnue.D'autre part, la famille des protéines régulatrices transmembranaires d'AMPAR (TARP) a été découverte au début des années 2000 et a été identifiée comme le médiateur clé du trafic des AMPAR et de la régulation de leurs propriétés biophysiques. Malgré les nombreux travaux réalisés, il manque encore des outils permettant d'étudier et de visualiser les TARP de surface sans compromettre et déstabiliser leur interaction avec les AMPAR. De plus, l'un des plus grands débats autour des sous-unités auxiliaires (en particulier les TARP), est de savoir si les sous-unités auxiliaires se dissocient ou non des complexes AMPAR à la membrane plasmique. Cette question est particulièrement importante car la dissociation des sous-unités auxiliaires pourrait potentiellement conduire à la réorganisation des complexes macromoléculaires des AMPAR, et ainsi façonner la transmission médiée par les AMPAR.L'objectif général de ma thèse était de développer de nouveaux outils pour étudier la dynamique des AMPAR et des protéines interagissant avec les AMPAR, en particulier la protéine FRRS1l et les TARP γ2 et γ8. Tout d'abord, je discuterai des stratégies que j'ai adoptées pour dévoiler le rôle de FRRS1l au cours des premières étapes de la biogenèse des AMPAR. En particulier, je rapporte le développement de nouveaux outils pour étudier l'interaction entre les AMPAR et FRRS1l en utilisant le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) basé sur la microscopie d'imagerie par fluorescence (FLIM). Mes résultats montrent que non seulement les AMPAR et FRRS1l interagissent directement dans les cellules vivantes, mais aussi que la carnitine palmitoyltransferase 1c (CPT1c), protéine résidant dans l’ER, coopère et améliore l'assemblage de FRRS1l et des AMPAR, comme cela a été suggéré précédemment. Deuxièmement, j’ai développé un nouvel outil pour marquer les TARP de surface dans les neurones vivants en utilisant la combinaison de l'expansion du code génétique avec le marquage par clic. Grâce à cet outil, nous avons pu démontrer l'organisation différentielle de surface de γ2 et γ8 à la fois dans des neurones hippocampiques dissociés et dans des cultures de tranches d'hippocampe. De plus, en utilisant la microscopie à super-résolution, nous avons démontré que γ2, mais pas γ8, est organisé en nanodomaines dans les synapses, comme précédemment rapporté pour les AMPARs.