Bio‐impression d’un hydrogel cellularisé pour l'obtention de matrices conjonctives lâches orales pré-vascularisées utilisables en ingénierie tissulaire

Abstract

Introduction : Bien que la muqueuse orale présente un potentiel de régénération efficace, certaines pertes de substances nécessitent une augmentation chirurgicale de la quantité et/ou de la qualité du tissu. La greffe autologue est la thérapeutique de référence mais possède trois inconvénients majeurs : une morbidité et une quantité de tissu limitée au niveau du site donneur ainsi qu’une connexion vasculaire lente du greffon au niveau du site receveur. L’ingénierie tissulaire (IT) peut pallier en partie ces problématiques en produisant des substituts tissulaires se rapprochant le plus possible des tissus natifs en termes de macro et micro architectures. La bio-impression 3D est une technique d’IT particulièrement prometteuse car elle permet de positionner les éléments cellulaires de façon précise tout en conservant leur viabilité. L’objectif de ce travail de recherche était donc d’obtenir un tissu mou conjonctif contenant des canaux verticaux et une pré-vascularisation horizontale à l’aide de la bio-impression 3D par extrusion (EBB) dans lequel la viabilité des cellules serait préservée in vitro pendant au moins un mois avec une étude pour la mise en place d’une application in vivo.Méthodes : Suivant la triade de l’IT cellules/scaffold/molécules, le modèle a été construit de la façon suivante : (a) les cellules étaient des fibroblastes gingivaux humains (hGF) issus de cultures primaires d’explants et des cellules endothéliales issues de la veine ombilicale (HUVEC) ; (b) le matériau (ou scaffold) a été sélectionné parmi de nombreux hydrogels afin de se rapprocher le plus des propriétés mécaniques du tissu tout en autorisant l’impression et la viabilité des cellules ; (c) aucune molécule bioactive n’a été ajoutée en dehors de celles déjà présentes dans les milieux de culture et de celles sécrétées par les cellules. Deux bio-imprimantes à extrusion ont été utilisées : MultiPrint (IUT de Bordeaux) dans un premier temps pour la prise en main puis 3D Discovery (RegenHU) pour les expériences in vitro. Les substituts bio-imprimés ont été maintenus en culture pendant 28 jours sans bioréacteur. Différents tests ont été effectués pour les caractériser : viabilité et activité cellulaire, caractérisation des cellules (cytométrie en flux et immunocytofluorescence) et quantification des pré-vaisseaux obtenus.Résultats : Après avoir démontré que les hGF pouvaient être bio-imprimés par extrusion dans un hydrogel et maintenus vivants en culture dans les substituts, une revue systématique de la littérature a été ciblée sur les stratégies utilisées en IT orale pour fabriquer des vaisseaux sanguins in vitro. Les techniques les plus utilisées étaient les co-cultures de cellules stromales et endothéliales en suivant des paramètres spécifiques . La mise au point des cocultures hGF/HUVEC a permis de découvrir des propriétés de certains fibroblastes qui, au contact des cellules endothéliales, se comportaient comme des cellules péri-vasculaires. Ceci a rendu possible l’ organisation et la stabilisation du réseau d’HUVEC in vitro pendant 30 jours. Enfin, ces co-cultures ont été bio-imprimées dans des formes contenant des canaux verticaux et l’organisation des vaisseaux dans les constructions a été suivie dans le temps in vitro avec une proposition de protocole in vivo chez le rongeur.Conclusion : Des substituts conjonctifs contenant des canaux verticaux et un pré-réseau vasculaire qui se maintient dans le temps sans bioréacteur peuvent être obtenus par EBB. Les propriétés péri-vasculaires d’une certaine partie des hGF jouent un rôle primordial. Il est dans un premier temps nécessaire de finir la preuve de l’intérêt de ces pré-vaisseaux avec des expérimentations in vivo pour prouver la connexion accélérée et efficace de la construction pré-vascularisée. Il sera ensuite possible de complexifier le modèle en ajoutant d’autres types cellulaires, en modifiant la forme 3D et en travaillant sur le gros animal pour se rapprocher des applications cliniques.