Caractérisation structurale des pili de type IV de bactéries à Gram positif

Abstract

Les travaux de cette thèse ont été axés selon trois thématiques. La première partie s'intéresse aux pili impliqués dans la transformation bactérienne. Au cours de ce processus, les bactéries capturent et incorporent de l’ADN exogène provenant de leur environnement et favorisant ainsi leur plasticité génétique et leur adaptabilité. La transformation bactérienne permet à de nombreux agents pathogènes humains d'acquérir une résistance aux antibiotiques et/ou d'échapper aux vaccins via l'incorporation de nouveaux gènes. Il a été précédemment démontré chez Streptococcus pneumoniae, que la première étape de ce processus, la capture de l’ADN à l’extérieur de la bactérie, est réalisée par un filament analogue aux pili de type IV, exposé à la surface de la bactérie : le pilus de transformation.L’objectif de ce projet est de résoudre la structure de ce filament, jusque-là inconnue, chez deux streptocoques modèles : Streptococcus pneumoniae et Streptococcus sanguinis. Le pilus de transformation a été purifié selon différentes méthodes. Nous avons obtenu une structure préliminaire à faible résolution du pilus de compétence de S. pneumoniae en utilisant la cryo-microscopie électronique. Durant cette étude, nous avons également mis en évidence un changement de morphologie du filament après purification, suggérant que son détachement de la surface de la cellule induit une possible dissociation des sous-unités et/ou un relâchement de la structure. Suite à ce constat, nous avons voulu obtenir la structure de ce filament in cellulo par cryo-tomographie. Afin d’augmenter le contraste des tomogrammes et de palier aux limitations technologiques du microscope, nous avons mis au point un procédé permettant d’affiner les cellules S. pneumoniae en utilisant une enzyme PAL provenant du phage lytique DP1. Nous avons montré par cette méthode que l’intégrité structurale de la membrane de ces bactéries lysées était conservée et que l’augmentation du contraste par l’affinement rendait possible l’observation de structure internes ou externes précédemment invisibles. Cette méthode permettra la visualisation du pilus de transformation in situ par cryo-tomographie. La seconde thématique est l’étude des pili de type IV. Ces filaments sont retrouvés à la surface d’un large éventail de bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif. Ces filaments ont des fonctions diverses et variées qui sont essentielles à la physiologie des bactéries (adhésion, motilité…). Au cours de ces deux dernières décennies, plusieurs structures de ces filaments ainsi que de leurs composants ont pu être obtenus. Ses études structurales ont permis de fournir une meilleure compréhension du fonctionnement des pili ainsi que de leur mécanisme d’assemblage. Cependant, l’ensemble de ces connaissances ont été relevées chez des bactéries à Gram-négatif. Jusqu'à présent aucune structure de filament de type IV issu d’une bactérie à Gram-positif n’avait été encore résolue.Nous nous sommes intéressés au filament de type IV d’une bactérie à Gram-positif : Streptococcus sanguinis. Après purification de ce filament et analyse de ce dernier par cryo-microscopie électronique, nous avons pu décrire pour la première fois la structure d’un filament de type IV issu d’une bactérie à Gram-positif.La dernière partie de cette thèse, plutôt d’ordre technologique, consistait à mettre en place, au sein de notre laboratoire et plus généralement sur le campus de Bordeaux, la cryo-microscopie corrélative. Ce type de technique permet de combiner l’information de localisation obtenue par la microscopie à fluorescence avec la haute résolution fournie par la microscopie électronique. Au cours de ce projet, nous avons dû dépasser plusieurs limites et effectuer de nombreuses optimisations afin d’implémenter cette méthode. Cette mise en place nous a permis de participer à plusieurs projets collaboratifs dont l’un où nous avons décrit pour la première fois l'observation de synapses dopaminergiques par cryo-tomographie.