Druggabilité des protéines spécifiques aux kinétoplastides liées à la traduction des ARNm : Etude par cryo-Microscopie Électronique

Abstract

Les kinétoplastides sont un groupe d'eucaryotes unicellulaires flagellés, qui comprend des espèces infectieuses pour les mammifères telles que Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei et Leishmania spp. Ils sont respectivement les parasites responsables des maladies de Chagas et de sommeil, et des les Leishmanioses. Les traitements actuels contre ces parasites sont basés sur des médicaments non spécifiques avec des effets secondaires agressifs, en plus des problèmes de résistance aux médicaments croissante. Le ribosome est une cible de choix pour un large éventail de molécules thérapeutiques (antibiotique). Le ribosome d’eucaryotes (appelé aussi le 80S) est composé d'une petite sous-unité (40S) et d'une grande sous-unité (60S). La traduction des ARNm est effectuée par le ribosome et est divisée en 4 étapes : l’initiation, l’élongation, la terminaison et le recyclage. L'initiation est une des étapes clé de la régulation du niveau de traduction des ARNm. Elle met en jeu une douzaine de facteurs initiateurs connus et passe par l'assemblage et le désassemblage de nombreux complexes intermédiaires. Comparé à celui des mammifères, le ribosome des kinétoplastides présente de nombreuses différences structurelles qui suggèrent des variations dans leur processus de traduction des ARNm. Parmi lesquels il y a une bona fide protéine ribosomique spécifique aux kinétoplastides qui a été découverte dans notre équipe et appelée ‘KSRP’ (« kinetoplastids-specific ribosomal protein »). KSRP interagit fortement avec le 40S via des régions spécifiques aux kinétoplastides, notamment les segments d'expansion d'ARNr (ES 3S et 6S) et la protéine ribosomique eS6 via sa queue C-terminale. Cependant, le rôle exact de KSRP reste inconnu. La spécificité et l'essentialité de KSRP (sa délétion est létale pour les parasites) en font une cible thérapeutique potentielle.Une autre protéine spécifique aux kinétoplastides impliquée dans la traduction a été devant rapportée par notre équipe. En effet, notre équipe a déterminé la structure du CPI (complexe de pré-initiation) 43S de T. cruzi par cryo-ME à une résolution de 3,33Å. L'analyse a révélé la présence de nombreux aspects spécifiques aux kinétoplastides, y compris la présence de une hélicase que nous avons appelée k-DDX60. k-DDX60 interagit avec le CPI formé sur le 40S au niveau de l’interface entre les sous-unité, et entraîne une stabilisation accrue du CPI et l'obstruction du canal d’interaction de l'ARNm dans le 40S. Bien que la fonction de k-DDX60 ne soit pas encore claire, son expression est essentielle pour ces organismes. En plus, il a été possible de démontrer que le CPI présente des différences structurelles importants par rapport à les mammifères, notamment au niveau de facteur d'initiation eucaryote eIF3 et de ses interactions avec les segments d’expansion 9S, 7S et 6S de l’ARNr.Au cours de ce travail, j'ai étudié ces deux protéines. 1- D’une part, j'ai établi un protocole efficace et reproductible pour la purification du CPI de L. tarentolae en conditions natives, ce qui a permis d'obtenir une structure de haute résolution de ce complexe apportant des données supplémentaires sur les interactions de k-DDX60 ainsi que son possible rôle. 2- D’autre part, j'ai créé des lignées de L. tarentolae avec des mutations ponctuelles sur KSRP (his-tagged) ainsi qu'un protocole de purification fiable basé sur un gradient de saccharose et une chromatographie d'affinité, ce qui m'a permis de purifier le ribosome portant différents mutants de KSRP dont les structures ont été résolues par cryo-ME. Il a permis l'identification de résidus cruciaux pour la liaison de KSRP sur 40S et en particulier, une poche d’interaction essentielle constituée de 3 résidus aromatiques.Ces découvertes ont remarquablement amélioré nos connaissances de la régulation du processus de traduction des ARNm chez ces parasites et ont le potentiel d'être exploitées pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques