Développement de méthodes de clonage de génomes entiers chez la levure pour la construction de souches châssis semi-synthétiques de Bacillus subtilis.

Abstract

Un des défis de la biologie de synthèse (BS), est d’apporter des solutions nouvelles à des enjeux globaux majeurs (thérapeutiques/sanitaires, climatiques), en particulier via la construction de souches de production utiles, performantes et respectueuses de l’environnement.Bacillus subtilis (Bsu) est une bactérie Gram+ non pathogène utilisée en biotechnologie comme plateforme de production de molécules d’intérêt. Or, des études récentes ont établi que des souches de Bsu génétiquement modifiées permettaient d’obtenir une plus grande production de protéines recombinantes. Cela suggère que la production de châssis Bsu réduits pourrait être une étape importante dans l’amélioration des souches à visée industrielle.Le projet ANR Bacillus 2.0 dans lequel s’inscrit cette thèse, vise à transposer à Bsu des outils récents du domaine de la BS, et à mettre en place un pipeline efficace pour construire à haut débit des châssis modulables selon l’application biotechnologique. Ce pipeline rassemble les technologies suivantes : (i) design d’un génome synthétique (ii) assemblage de fragments d’ADN chevauchants au sein de la levure Saccharomyces cerevisiae (iii) isolement du génome et transplantation dans une cellule receveuse bactérienne et (iv) sélection et caractérisation des souches mutantes.Les objectifs de cette thèse étaient d’attester la faisabilité de ces méthodes, en tentant de cloner et maintenir le génome réduit de Bsu MPG192 (2,86 Mb) dans la levure, puis de le modifier avec les outils d’ingénierie disponibles chez S. cerevisiae. Dans un premier temps des stratégies déjà décrites dans la littérature ont été déployées afin de cloner le génome entier de Bsu, mais sont restées infructueuses. En nous basant sur une approche de TAR-Cloning, nous avons tenté de cloner plusieurs fragments obtenus par restriction du génome de Bsu. Initialement, seuls cinq fragments sur sept ont été clonés. L’incapacité à cloner le plus grand de ces fragments (1,50 Mpb) est vraisemblablement due à un manque d’ARS et/ou à sa taille. Concernant le second fragment, un ensemble de facteurs peuvent expliquer notre échec : à nouveau le manque d’ARS mais aussi, la présence de nombreux éléments répétés (7 opérons ribosomiques) ou l’expression délétère de ces gènes. Finalement, d’autres expérimentations ont permis de découper le génome en sous-fragments de tailles variables (6kb à 515kb) et ainsi de cloner en 21 morceaux la totalité du génome de Bsu MGP 192. Le TAR-Cloning imposant des contraintes dans le choix des sites de restriction, une nouvelle méthode de clonage, appelée CReasPy-Fusion, a été développée. Elle combine le système d’édition CRISPR-Cas9 et la fusion entre des sphéroplastes de levure et des cellules bactériennes. Comme preuve de concept, nous avons d’abord travaillé avec six espèces de mycoplasmes, et démontré qu’il est possible de cloner et modifier des génomes entiers. Cette approche a ensuite été transposée à Bsu, validant pour la première fois la fusion entre des sphéroplastes de levure et des protoplastes de bactéries Gram+. Elle a permis la capture précise d’un fragment d’environ 150kb.Bien que le génome entier de Bsu n’ait pas été cloné dans la levure à ce jour, plusieurs éléments critiques ont pu être identifiés. Tout d’abord, ces travaux soulignent l’importance de la méthode de clonage à adopter en fonction de l’organisme avec lequel on travaille. Ensuite, ils mettent en exergue l’existence de facteurs biologiques et techniques qui expliquent les difficultés actuelles et qui devront être pris en compte dans la suite des expérimentations. Enfin, ils ont permis le développement d’une nouvelle technique de clonage appelée CReasPy-Fusion, qui vient étoffer le catalogue des méthodes déjà décrites. Par sa versatilité, elle ouvre des perspectives pour la capture de grands fragments de génome, pour l’élimination de loci problématiques, ou encore, en appui à l’assemblage de fragments synthétiques.