Mécanisme enzymatique d’une Peroxydase à hème d’origine bactérienne et couplage par chimérisation avec une Glucose oxydase.

Abstract

Les infections nosocomiales urinaires représentent 30% des infections contractées lors d’un séjour à l’hôpital. La résistance aux antibiotiques des micro-organismes responsables de ces infections est à l’origine de ce nombre puisque les personnes atteintes deviennent de plus en plus difficiles à soigner. Depuis une dizaine d’années un nouveau challenge est apparu : développer de nouvelles techniques pour prévenir et guérir les infections nosocomiales (comme des composés chimiques microbiocides, des peptides ou des phages antimicrobiens). Notre stratégie est de produire un cathéter urinaire anti-adhérent et antimicrobien recouvert d’un système enzymatique couplé. La 1ère enzyme de ce système est la Glucose oxydase (GOx) dont le produit sert de substrat à la 2ème enzyme qui est une Peroxydase à hème. L’objectif de ces travaux de thèse a été de caractériser l’activité enzymatique de la Peroxydase à hème putative non connue de la littérature. Après avoir produit et purifié l’enzyme de manière originale, l’étude de la reconstitution puis du relargage de l’hème a été possible avec la mesure de l’extinction de fluorescence des tryptophanes et l’utilisation de l’acide 4-aminobenzoïque hydrazine, un inhibiteur de l’enzyme. Son activité d’halogénation a été mise en évidence à l’état stationnaire avec la caractérisation de ses constantes biochimiques pour chacun de ses substrats (les halo ou pseudo-halogénures SCN-, Br-, Cl- et l’H2O2) au stopped-flow et avec l’utilisation de la sonde fluorescente Aminophenylfluorescéine. La variation du pH et de la température lors de ces expériences a permis de fournir des informations concernant l’activité optimale de l’enzyme. L’étude de l’état pré-stationnaire a permis de mettre en évidence la présence d’un intermédiaire réactionnel lors du cycle catalytique de l’enzyme, appelé Composé I. Des activités Catalase et Peroxydase ont aussi été mises en évidence. La 1ère a été caractérisée par une diminution de l’absorbance à 240 nm, témoignant de la consommation de l’H2O2 par l’enzyme. La 2ème a été mise en évidence par l’oxydation de l’ABTS, substrat classique des Peroxydases, mis en évidence par l’augmentation de l‘absorbance à 436 nm. La stabilité à différentes températures, différents pH et dans différents milieux suggère que la Peroxydase a hème est active plusieurs mois, notamment à 4°C, ce qui est un résultat prometteur compte tenu de l’application finale souhaitée. La fusion des cadres ouvert de lecture codant une GOx et la Peroxydase à hème par deux techniques de génie génétique a permis l’obtention de protéines chimériques dans le but d’optimiser le transfert de substrat entre les deux sites actifs et d’augmenter la concentration locale des substrats au niveau des sites actifs. Cette nouvelle construction, aura aussi pour but de favoriser l’immobilisation du complexe enzymatique sur le cathéter urinaire. Tous ces résultats vont en faveur d’un système enzymatique couplé actif et stable dans le temps qui nécessite maintenant d’être étudié une fois fixé sur une surface siliconée. L’étude des composés microbiocides produits devra aussi être envisagée sur des souches pathogènes responsables des infections nosocomiales comme Candida albicans, Escherichia coli, Streptococcus aureus …