Etude du transcriptome de Caenorhabditis elegans par la technique de séquencage nanopore

Abstract

Une récente méta-analyse de l’utilisation des jonctions exon-exon chez C. elegans nous a permis d’améliorer notre compréhension de son transcriptome, en particulier pour la quantification des événements d’épissage alternatif au sein des ARNs messagers. Cependant, les technologies de séquençage NGS, comme l’Illumina, se montrent limitées pour l’étude des transcriptomes. Ces technologies, basées sur la PCR, entraînent l’apparition de biais d’amplifications qui affectent la distribution des ARNms détectés au sein d’une expérience, et la petite taille des fragments générés n’est pas adapté pour correctement déterminer la fréquence des isoformes issus des différents événements d’épissage alternatifs.Dans cette étude, nous avons utilisé les nouvelles possibilités offertes par les séquenceurs Oxford Nanopore Technology (ONT) pour nous affranchir de ces limitations. Le séquençage nanopore nous permet de séquencer directement des molécules d’acides nucléiques sans avoir recours à des étapes d’amplification, et permet de générer des fragments pouvant couvrir la taille totale de la molécule séquencée. Ceci nous permettant de mieux caractériser le transcriptome de C. elegans, en effectuant une mesure plus précise des fréquences d’isoformes, et en nous permettant une meilleure compréhension des événements d’épissage alternatif et de trans-épissage qui affectent les messagers.Nous avons évalué trois différents kits de séquençage commercialisés par ONT et nos résultats suggèrent que le kit de séquençage direct-cDNA est plus adapté aux études de transcriptomes, en termes de quantité et de qualité de données générées. À la suite de cette analyse, plusieurs séquençages direct-cDNA ont été réalisés sur différentes populations d’ARNs : des librairies d’ARNs poly(A) représentants le transcriptome entier de C. elegans, et des librairies enrichies en ARNs SL1. Nos résultats indiquent que les ARNs trans-épissés se comportent différemment lors de la préparation des librairies ONT et que les phénomènes de trans-épissage sont plus prédominants que précédemment rapporté. Enfin, nous montrons que les promoteurs alternatifs peuvent conduire à la génération de populations d’isoformes présentant différents statuts de trans-épissage.