Développement de nouvelles méthodes de microscopie et d’électrochimie pour des analyses multi-paramétriques de mitochondries individuelles cardiaques

Abstract

L’importance de la mitochondrie dans la gestion de l’énergie cellulaire, d’un point de vue physiologique (contraction cardiaque, etc) ou pathologique (cancer, Alzheimer, etc) n’est plus à démontrer. Dans le contexte de la contraction cardiaque, qui est un processus fortement ATP-dépendant, l’intervention exacte de la mitochondrie reste aujourd’hui sujet à débat. Une hypothèse avance que la mitochondrie ne voit qu’un faible pourcentage (1%) du flux calcique nécessaire à la contraction, une autre hypothèse propose que la mitochondrie, qui produit 90% de l’ATP cellulaire, est activée par ce flux calcique à chaque contraction pour répondre à la demande énergétique. Un élément de réponse pourrait être l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial (mPTP), qui est principalement activé par le calcium. Si ce pore non spécifique est principalement connu pour son ouverture pathologique, notamment dans l’ischémie-reperfusion en déclenchant l’apoptose, c’est son mode d’ouverture physiologique qui serait important dans ce contexte cardiaque en jouant un rôle crucial dans la gestion des flux calciques mitochondriaux. Cependant, ce mode d’ouverture est encore peu caractérisé, notamment car les techniques utilisées reposent bien souvent sur le suivi moyen de large population mitochondriales, or de plus en plus d’études montrent l’existence de sous populations mitochondriales au sein d’une même cellule, présentant des différences d’activités entre elles. L’objectif de cette étude était de développer des nouvelles méthodes d’analyse, afin de pouvoir suivre les variations d’activités des populations mais surtout, de pouvoir analyser les mitochondries individuellement. En utilisant ces méthodes, des études des ouvertures physio-pathologiques du mPTP dans le contexte de contraction cardiaque peuvent être menées.La première approche que j’ai développée est basée sur la microscopie optique, elle se compose de trois grandes étapes : 1) traitement des images de microscopie, 2) identification des mitochondries et leur suivi dans le temps, 3) analyses informatiques. La deuxième approche a été basée sur l’électrochimie, elle repose sur une détection simultanée de la consommation d’oxygène mitochondriale et du taux de réduction des quinones de la chaine respiratoire. Pour caractériser ces méthodes, nous avons dans un premier temps suivi les états bioénergétiques mitochondriaux classiques. Nous avons ainsi montré une grande variété de réponses avec l’observation de deux sous-populations mitochondriales de tailles distinctes. Puis, dans un deuxième temps nous avons utilisé la microscopie de fluorescence pour suivre sur mitochondrie unique, des variations transitoires du potentiel de membrane que l’on relie aux ouvertures du mPTP. Nous avons ainsi confirmé que l’activation du mode d’ouverture pathologique peut être induit par un front de concentration de calcium, et est inhibé par la cyclosporine A (CsA). Surtout, nous avons observé des ouvertures transitoires du mPTP, activé également par le calcium mais également par la photo-illumination, en revanche dans notre étude ce mode d’ouverture n’est pas inhibé par la CsA ce qui suggère d’un mécanisme différent.