Etudes biochimiques et structurales de glucose déshydrogénases soluble et membranaire

Abstract

A ce jour, deux types de glucose déshydrogénases (GDH) à pyrrolo-quinoléine quinone (PQQ), ont été identifiés: une enzyme de type membranaire (mGDH) et une enzyme de type soluble (sGDH). Bien que les deux GDHs soient phylogénétiquement et structurellement distinctes, elles catalysent la même réaction d’oxydation du glucose en gluconolactone chez les bactéries à Gram négatives. Cette activité d’oxydation les rend particulièrement adaptées pour des utilisations dans des biocapteurs à glucose. Depuis la fin des années 70, la sGDH a largement été étudiée et utilisée comme enzyme anodique du fait de son activité catalytique élevée et de son insensibilité au dioxygène. L’enzyme présente cependant deux inconvénients : (i) une large spécificité de substrat, conduisant à des mesures imprécises de la glycémie, (ii) une faible stabilité dans le temps, inférieure aux autres enzymes à glucose. Comparée à la sGDH, peu d’informations sont disponibles sur la mGDH, principalement en raison des difficultés rencontrées lors de la production de la protéine. Toutefois, comme elle est naturellement immobilisée dans les membranes, cette enzyme offre un grand potentiel pour optimiser le transfert des électrons à la surface des électrodes. L'objectif de ce travail de thèse était de caractériser biochimiquement et structurellement les PQQ-GDHs pour de potentielles applications dans des biocapteurs à glucose. Les limites de production de la mGDH d'Escherichia coli et d'Acinetobacter calcoaceticus ont été éliminées à l'aide d'un système d'expression in vitro. La mise au point d’un protocole d’activation de la mGDH est encore en cours d’étude. Les études structurales par dichroïsme circulaire et microscopie électronique en coloration négative laissent penser que les enzymes sont correctement repliées. Pour la sGDH d’A. calcoaceticus, des études de relation structure/fonction ont été réalisées sur l’holo-enzyme sauvage et sur deux mutants (Y343F et D143E/Y343F), sélectionnés pour leur plus grande spécificité pour le glucose. La détermination de la structure des trois enzymes par diffraction des rayons-X a permis d'identifier un cofacteur clivé. Un clivage similaire du PQQ isolé a été décrit dans des conditions acides et lors d'un traitement par H2O2. La preuve est ici apportée que les enzymes sGDH sous forme apo ou holo catalysent la production d’H2O2 de façon directe ou indirecte. Des expériences spectroscopiques ont permis de suivre la dégradation du PQQ et la perte de l’activité d'oxydation du glucose après incubation à 25 °C. Ces résultats suggèrent que la sGDH est sensible à son auto-production d’H2O2. L’ajout de catalase permet de consommer une partie de l’H2O2 produit in situ, ce qui a pour conséquence d’améliorer la stabilité de l’enzyme dans le temps et à 25 °C.Cette thèse s’articule en deux parties. La première partie est consacrée aux travaux portant sur les mGDH, en soulignant les aspects clés tels que leur expression acellulaire, la caractérisation biochimique et biophysique ainsi que les premières études structurales réalisées. Dans la seconde partie, les structures très hautes résolution de l’holo-sGDH sauvage et des deux mutants Y343F et D143E/Y343F (1.19 Å, 1.56 Å et 1.48 Å respectivement) sont présentées et une explication à l'origine de leur instabilité dans le temps est proposée. Ces travaux présentent un intérêt pour la communauté en Enzymologie et en Electrochimie puisqu’ils ouvrent de nouvelles perspectives pour comprendre le mécanisme d’autoproduction d’espèces réactives de l’O2 par l’enzyme ainsi que sur l’optimisation des capteurs à glucose ou plus largement des biopiles à glucose/O2.