Différenciation induite mécaniquement de cellules souches à trois dimensions : étude par imagerie optique quantitative.

Abstract

Une cellule souche est une cellule qui a la capacité de s'auto-renouveler, de se multiplier à l'infini et de se différencier en des cellules spécialisées. Placée dans son microenvironnement, elle est soumise à une myriade de signaux chimiques et physiques qui régulent son destin cellulaire. De nombreuses études, conduites in vitro sur des cellules souches isolées ou en monocouche, ont mis en évidence le rôle crucial des forces extérieures ou des propriétés mécaniques des substrats dans le déclenchement et l’orientation de la différenciation cellulaire via des processus de mécanotransduction ou mécanosensation dont certains acteurs moléculaires ont été élucidés. La validation ou infirmation de ces mécanismes dans un environnement tridimensionnel (3D), qui récapitule plus fidèlement l’architecture des tissus biologiques, exige cependant le développement de nouvelles approches. En effet, il n’y a plus de substrat proprement dit, et comment appliquer ces forces pendant une durée suffisante pour influencer la différenciation.Notre stratégie est de générer des organoïdes encapsulés dans des coques d'hydrogel transparentes, perméables et élastiques. Ce système de culture cellulaire à 3D nous permet d’étudier par microscopie optique la croissance de l’organoïde en conditions de croissance libre ou confinée élastiquement. Pour permettre le suivi en temps réel de la différenciation, nous avons choisi comme système cellulaire d’étude des cellules souches adipeuses (ou pré-adipocytes) qui ont la particularité de subir une forte augmentation de volume (hypertrophie) due à l’apparition et l’accumulation de gouttelettes lipidiques au cours de leur différenciation en adipocytes. Ainsi, la croissance de l’organoïde est a priori déterminée par la combinaison de deux effets : l’augmentation du nombre de cellules souches adipeuses par prolifération et l’augmentation du volume cellulaire des pré-adipocytes en cours de différenciation. Par une méthode tout-optique associant suivi morphométrique par microscopie à contraste de phase et suivi structural par microscopie de fluorescence à sectionnement optique, nous avons montré, en l’absence de signal chimique adipogénique, que la prolifération cellulaire est considérablement réduite à 3D par rapport à 2D et que le processus de différenciation des cellules souches adipeuses est déclenché par simple agrégation dès la formation de l’organoïde. Alors que cette différenciation « spontanée » n’apparait à 2D qu’une fois la confluence atteinte et la prolifération complètement arrêtée, la formation d’un organoïde place intrinsèquement les cellules dans un contexte de confluence. En bref, par le développement d’une pipeline méthodologique d’analyse d’organoïdes en cours de différenciation, nous apportons, sur une étude de cas, une preuve nouvelle de l’influence cruciale de la dimensionalité sur le destin cellulaire. Enfin, ce travail se termine par une partie exploratoire indépendante autour de nouvelles méthodes d’encapsulation visant à concevoir des capsules d’hydrogel présentant une plus grande variété de propriétés physico-chimiques.