Imagerie 3D de cellules vivantes de micro-tissus neuronaux in vitroà l'aide de la microscopie à balayage d'images spectrales

Abstract

Les modèles cellulaires tridimensionnels se sont avérés plus pertinents sur le planphysiologique que les plaques de culture bidimensionnelles. Plus précisément, pourimiter les connexions et les activités synaptiques de type in vivo, un modèle expérimentalrécemment développé, connu sous le nom de sphéroïdes - des agrégations decellules en 3D - a été utilisé pour étudier les réseaux neuronaux[1] [2]. Cependant, lesmodèles existants sont de grande taille (>100 μm) et ne se prêtent pas à l’imagerie3D de cellules vivantes à la résolution d’une cellule unique en raison de la limite dediffraction et de pénétration de la lumière.Nous avons ici combiné un modèle 3D invitro pour étudier les contacts synaptiques avec une technique d’imagerie qui permetde suivre les événements dynamiques au niveau synaptique avec une haute résolutionspatio-temporelle et spectrale. Dans ce travail, les sphéroïdes neuronaux sontformés dans des modèles d’hydrogel de taille et de forme standardisées. Ces modèlesà base d’hydrogel sont fabriqués à l’aide d’un système de projecteur UV à motifs,d’un macromonomère et d’un photoinitiateur par un processus de polymérisationradicalaire. Le résultat est un substrat dont la rigidité est proche des conditionsphysiologiques et qui permet l’auto-agrégation des neurones. Les sphéroïdes formésdans ces gabarits ont montré une organisation et des caractéristiques biochimiquessimilaires à celles rapportées précédemment. Les neurones dans les sphéroïdes ontété transfectés de manière sélective et éparse avec des rapporteurs fluorescents. Pourréaliser l’imagerie 3D en direct du modèle, nous avons mis au point une nouvelle techniquede microscopie à balayage d’images spectrales avec des capacités de sectionnementoptique et de résolution spectrale. Un dispositif numérique à micro-miroirsgénère des éclairages ponctuels qui permettent de réaliser des coupes optiques àl’aide d’un algorithme de discrimination. Pour générer des images multicolores, unprisme est utilisé pour disperser la lumière d’émission le long de son axe et collectéepar une caméra CMOS rapide. Par colocalisation, sommation et filtrage spatial, lebalayage spectral de l’image génère une image avec une résolution spatiale de 350nm latéralement et 450 nm axialement. L’imagerie prolongée (20 heures) de neuronestransfectés avec la GFP et le tdtomato met en évidence la capacité de l’ISMspectral pour l’imagerie 3D de cellules vivantes. La combinaison d’un ISM Spectralbasé sur la DMD et de modèles d’hydrogel présente un grand potentiel pour desétudes plus poussées des cellules du cerveau humain au niveau des synapses dansun environnement 3D utilisant des cellules souches pluripotentes induites.