CRISPR/Cas9 chez les mollicutes : Du système naturel aux outils d’ingénierie de génome

Abstract

Les systèmes CRISPR/Cas sont largement représentés chez les bactéries et les archées et sont à la base de mécanismes de défense adaptatifs contre l’ADN et l’ARN exogène. De par son intérêt comme outil génétique, le système CRISPR de type II de Streptococcus pyogenes a été particulièrement étudié. Il est composé principalement d’une endonucléase Cas9 et d’un sgRNA qui a pour rôle de guider Cas9 jusqu’à une séquence cible, la spécificité de reconnaissance dépendant également d’une séquence NGG située en aval appelée PAM. Les mollicutes sont des bactéries minimales, dépourvues de paroi et qui utilisent, pour la plupart, un code génétique alternatif. Elles possèdent de petits génomes riches en AT (~70-75%) allant de 0,58 à 2,2 Mpb. La plupart d’entre elles ont un mode de vie parasitique et sont des pathogènes d’une grande diversité d’hôtes (plantes et animaux y compris humains). Chez la plupart des mollicutes, les possibilités d’ingénierie génomique restent limitées car la recombinaison homologue est peu efficace. Le but de ma thèse a été de (1) caractériser les systèmes CRISPR//Cas9 des mollicutes, (2) développer un outil endogène CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie de génome de mollicutes et (3) d’étendre cette boite à outils chez certaines espèces d’intérêt pour lesquelles aucun outil génétique de précision n’était disponible.La première partie de mon travail de thèse était l’étude globale des systèmes CRISPR chez les mollicutes. Une reconstruction phylogénétique a permis de mettre évidence une origine commune pour tous les systèmes CRISPR de mycoplasmes et deux origines pour les systèmes de spiroplasmes. L’étude structurale de la protéine Cas9 des mollicutes montre une forte proximité structurale avec la protéine Cas9 de Staphylococcus aureus à l’exception du domaine PI qui intervient dans l’interaction avec la séquence PAM, ce qui suggère que les séquences PAM des systèmes de mollicutes sont sans doute très différentes. Le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mgal), un pathogène d’oiseau, a ensuite été l’objet d’une étude approfondie. Le système naturel a été démontré comme fonctionnel in vivo et le système minimal composé de la MgalCas9 et d’un sgRNA a permis d’induire un clivage de l’ADN in vitro. Une différence de séquence PAM consensus a été observée entre deux souches de Mgal isolées de poulet et de pinson et a pu être mise en corrélation avec le récent changement d’hôte du pathogène et l’émergence de celui-ci dans les populations de pinsons d’Amérique. Un plasmide « all-in-one » contenant le système a été conçu, et la fonctionnalité du système comme outil précis de clivage a été démontré dans différentes espèces, notamment Mgal, Mycoplasma capricolum (Mcap), Mycoplasma pulmonis et Mycoplasma mycoides. Cet outil de contre sélection a été appliqué à Mcap afin de curer son génome d’un élément mobile intégré de 23 kpb (ICE). Finalement, pour pallier à la faible efficacité de recombinaison des mycoplasmes, deux nouveaux outils d’ingénierie génomique ont été mis au point. Un outil « CRISPR Base Editor », composé d’une protéine Cas9 désactivée, fusionnée à une protéine de type déaminase, qui permet de faire des modifications de base de manière très ciblée. La fonctionnalité de cet outil, très efficace et simple d’utilisation, a été validée dans 3 espèces pathogènes majeures de mycoplasmes. Le second outil est basé sur l’importation d’un système de recombinaison RecET issu de phages. Chez Mgal, cet outil d’ingénierie de génome permet ainsi pour la première fois de réaliser des modifications précises à plus grande échelle (délétions, insertions et remplacements).En conclusion, nos travaux ont concerné l’étude fonctionnelle des systèmes CRISPR des mycoplasmes et le développement d’outils d’ingénierie de génomes chez ces mêmes bactéries. Ce travail ouvre de manière significative les possibilités d’étude et d’utilisation des mycoplasmes pour des applications biotechnologiques.