Étude de la pharmacologie moléculaire et de la régulation du canal TRPV1 à l’aide de la technique du transfert d’énergie en résonance de bioluminescence (BRET)

Abstract

Malgré leur potentiel en tant que cible thérapeutique, moins de 20% des canaux ioniques sont actuellement exploités pour chercher de nouveaux médicaments. Pour le criblage à haut débit (HTS) des canaux ioniques, le patch-clamp automatisé (APC) est la technique de référence, mais il permet un débit moyen, reste coûteux et nécessite une manipulation experte. Pour les étapes précoces de criblage de médicaments, les sondes à fluorescence sont souvent préférées et confirmées ultérieurement par APC. Ces techniques mesurent des événements moléculaires distants spatialement et temporellement du canal étudié, ce qui favorise une fréquence élevée de faux positifs. Cet inconvénient peut être contourné en mesurant les événements à proximité du canal ionique étudié. Au cours des vingt dernières années, les approches basées sur le transfert d'énergie par résonance (RET) ont offert de nouvelles opportunités pour sonder l'activité d'une liste toujours croissante de protéines dans les cellules vivantes, en temps réel. Ces techniques s’appuient sur le transfert d'énergie non-radiatif entre un donneur d'énergie et un accepteur d'énergie fluorescent compatible. Un tel mécanisme quantique repose strictement sur la proximité moléculaire (environ 100 Å) et l'orientation entre les molécules donneuses et acceptrices pour le transfert d'énergie. Il s'agit d'un système de choix pour mesurer la dynamique des interactions et des changements de conformation des protéines. Parmi les différentes techniques RET, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est une méthode accessible et abordable, qui est de plus en plus largement utilisée pour étudier l'activité des protéines dans les systèmes vivants. L'élimination du besoin d'une source de lumière externe pour l'excitation des donneurs donne au BRET certains avantages par rapport aux techniques connexes telles que le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET). Grâce à ces avantages, le test BRET a été largement mis en œuvre pour étudier l’activité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des kinases. L’objectif de cette thèse est de développer plus avant l’utilisation de la technique de BRET pour l’étude fonctionnelle et pharmacologique des canaux ioniques dans les cellules vivantes. Grâce à diverses sondes BRET intra- et inter- moléculaires, nous avons réalisé le suivi dynamique de l’activité et de la régulation du canal TRPV1 à divers niveaux, en mesurant : (i) les changements conformationnels, (ii) le couplage avec l’un de ses partenaires fonctionnels la Calmoduline (CaM), (iii) la concentration d’ion proximal situé sous le canal et iv) sa distribution subcellulaire. Ces différents modes de lectures permettent d’éclairer la pharmacologie de TRPV1 sous un nouveau jour en nous donnant accès à des paramètres qu’il n’est pas possible de mesurer à l’aide de techniques conventionnelles comme la patch-clamp ou les sondes à fluorescence. Les sondes BRET mesurant les changements de conformation de TRPV1 et son couplage à la CaM ont été évaluées en tant que nouvelle méthode HTS en criblant la banque Prestwick, une bibliothèque chimique de petite taille avec une grande diversité structurelle, à la recherche de composés agonistes et antagonistes de TRPV1. L’analyse multiparamétrique résultante a permis de montrer la capacité des inhibiteurs de la CaM à moduler l’activation chimique de TRPV1. Une analyse plus poussée de ce phénomène a mis en exergue l’importance du couplage fonctionnel de TRPV1 avec la CaM pour le maintien de TRPV1 à la membrane plasmique. Enfin, dans un dernier volet, nous montrons que certains ligands peuvent moduler la sélectivité cationique au travers du canal TRPV1 et de certains canaux P2X. Ceci représente une opportunité thérapeutique potentielle pour cibler des voies spécifiques qui ne produisent que les effets attendus, tout en évitant les effets indésirables induits par les différentes cascades de signalisation.