Sécurisation de la thérapie génique par CRISPR-Cas9 dans les pathologies du globule rouge

Abstract

L’objectif de ce travail a été d’étudier la génotoxicité de la thérapie génique par CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats)-Cas9 (CRISPR associated protein) et de proposer une sécurisation dans des modèles de maladies héréditaires du GR, la porphyrie érythropoïétique congénitale et les béta-hémoglobinopathies. Les bêta-hémoglobinopathies comprennent la drépanocytose et la bêta-thalassémie et sont les maladies monogéniques les plus fréquentes dans le monde contrairement à la porphyrie érythropoïétique congénitale qui est très rare. La thérapie génique pourrait être une approche thérapeutique prometteuse pour ces maladies graves. L'édition du génome par CRISPR-Cas9 est revendiquée comme une alternative à la thérapie génique additive. Nous avons utilisé les coupures doubles brins d’ADN induites par la nucléase Cas9 au locus UROS pour éditer la porphyrie érythropoïétique congénitale et au locus bêta-globine pour éditer les bêta-hémoglobinopathies. Nous avons démontré qu'après une seule coupures double brin d’ADN par CRISPR, les insertions-délétions au site de coupure du locus UROS sur le chromosome 10, pouvaient être concomitantes de grandes délétions chromosomiques inattendues dans des lignées cellulaires mais aussi dans des cellules primaires déficientes pour TP53. Nous avons confirmé ce résultat au locus bêta-globine sur le chromosome 11 dans une lignée cellulaire. De plus, dans les cellules souches hématopoïétiques, nous avons décrit un autre type de génotoxicité au locus bêta-globine : des pertes d'hétérozygotie copies neutres conduisant à une disomie uniparentale partielle 11p15.5. Ces nouvelles données sont cruciales car les thérapies géniques basées sur CRISPR-Cas9 sont en cours pour les bêta-hémoglobinopathies chez les patients. Au total, ces effets secondaires sont à prendre en compte pour la modélisation de maladies et pour la thérapie génique. Nos données mettent en évidence la nécessité de contrôler et d'améliorer la sécurité de CRISPR-Cas9 et nous avons proposé une alternative à CRISPR-Cas9-nucléase grâce à l'utilisation de la nickase dans une lignée cellulaire.