Étude du métabolisme de l'amidon dans le fruit tomate avec des approches de génétique directe et inverse

Abstract

L’amidon joue un rôle central pendant le développement et la maturation des fruits. Sa dégradation fournit de l’énergie et des sucres aux fruits en maturation tandis que son accumulation répond aux stress environnementaux. La connaissance du métabolisme de l’amidon dans les feuilles s’est considérablement améliorée, principalement grâce à la caractérisation des mutants d’Arabidopsis (sans amidon ou excédentaire), mais on en sait très peu sur les fruits. Dans cette étude, nous avons utilisé des approches de génétique directe et inverse pour obtenir des mutants de tomate produisant des fruits avec un excès d’amidon.Pour mener la démarche de génétique directe, nous avons combiné l’utilisation d’une plateforme robotisée permettant le dosage d’amidon à haut-débit avec celle d’une importante population de mutants EMS, et réalisé un criblage en utilisant des fruits rouges de près de 3000 individus. Trois candidats avec un excès d’amidon ont été trouvés, dont un (P17C12) a ensuite été confirmé avec une mutation récessive. Une grande population BC1F2 a été phénotypée puis utilisée pour localiser la mutation en utilisant une approche de cartographie par séquençage. Les résultats de l’analyse ont montré que la localisation la plus probable de la mutation est à l’extrémité du chromosome 1, avec 1 mutation KO, 2 mutations « faux-sens » et de nombreuses mutations dans des régions non codantes. Nous avons décidé de tester la RecQ hélicase 4 (RECQ4, Solyc01g103960, KO), un membre de la famille des protéines de transport mitochondrial (MCF, Solyc01g095510, « faux-sens »), un transporteur de phospholipides à ATPase (PTA, Solyc01g096930, « faux-sens »), un ORF situé en 5’ d’une protéine de fonction inconnue (CPuORF, Solyc01g105700, 5’ UTR) et la Rubrédoxine (Solyc01g097910, 3’UTR). Nous avons créé des mutants homozygotes KO ou faux-sens en utilisant CRISPR/Cas9 pour les gènes candidats RECQ4, MCF et PTA, et des mutants homozygotes avec mutations d’insertion / suppression dans le 5’ UTR pour CPuORF, mais aucun n’a montré de phénotype avec excès d’amidon. Pour la Rubrédoxine, en plus de créer des mutants KO et des mutants avec des mutations similaires dans 3’ UTR avec CRISPR/Cas9, nous avons également produit des plantes surexprimant la Rubrédoxine car chez mutant PP17C12, l’ARNm de la Rubrédoxine était fortement exprimé dans le fruit vert des lignées BC1F1 et S2. Le développement du mutant KO pour la Rubrédoxine (homozygotes) ne va pas au-delà du stade cotylédon. Les mutants avec des mutations dans 3’ UTR, qui n’ont montré aucun changement dans la quantité d’amidon ou les niveaux d'ARNm de Rubrédoxine. Certaines plantes ont montré des expressions 100 fois plus élevées de Rubrédoxine dans les feuilles, mais aucune n’a montré d’augmentation significative de la quantité d'amidon dans les fruits. Finalement, nous n’avons trouvé le phénotype avec excès d’amidon dans les fruits pour aucun des cinq gènes candidats testés, ce qui implique que davantage d'investigations seront nécessaires pour affiner la cartographie et identifier la mutation responsable de ce phénotype.En utilisant une approche de génétique inverse, nous avons sélectionné une alpha-amylase (AMY3.2) et trois bêta-amylases (BAM1.2, BAM3.2 et BAM9), pour lesquelles nous avons créé des mutants KO par CRISPR/Cas9. Nous avons obtenu des mutants KO homozygotes pour AMY3.2 et BAM9, et des mutants KO hétérozygotes pour BAM1.2 et BAM3.2 dans la génération T1. L'absence de BAM9 a conduit à une mauvaise fertilisation menant à une réduction du nombre de graines et à une diminution de la taille des fruits chez la plupart des mutants. Chez ces mutants, la quantité d'amidon était remarquablement élevée dans les fruits âgés de 35 DAP. Ces résultats préliminaires suggèrent que BAM9 pourrait jouer un rôle important dans la viabilité du pollen et dans la dégradation de l’amidon des fruits pendant le mûrissement.