Etude cinétique de la liaison élémentaire entre Annexine-A5 et membranes et mise au point d’un test de quantification des microparticules plasmatiques pro-coagulantes, par cytométrie en flux

Abstract

L’Annexine A5 (AnxA5) est une protéine soluble se liant aux membranes contenant de la phosphatidylsérine (PS) en présence de calcium (Ca2+). Le rôle central joué par l’AnxA5 dans les processus de réparation membranaire a été récemment mis en évidence. L’AnxA5 possède une très forte affinité pour les membranes biologiques contenant de la PS, cependant son mode de liaison aux membranes n’est pas encore élucidé.La première partie de mon travail de thèse a concerné le développement d’une approche originale d’étude de la liaison de l’AnxA5 à des microsphères de silice fonctionnalisées par une bicouche lipidique (µPSiO2@SLB pour supported lipid bilayer), par cytométrie en flux (FCM). Cette approche m’a permis d’étudier la liaison à l’équilibre et en cinétique à très faible concentration en AnxA5, de l’ordre du picomolaire. Cette approche représente une des méthodes les plus sensibles d’étude de liaison à l’équilibre et la première permettant d’accéder aux constantes cinétiques d’interaction pour l’AnxA5. Cette étude m’a également permis de mettre au point une stratégie de dosage indirect de liposomes contenant de la PS avec une sensibilité de l’ordre du nanogramme de lipides par millilitre.La seconde partie de ma thèse a concerné l’étude de microparticules (MP), fragments de membranes cellulaires présents dans les fluides biologiques. Dans le plasma sanguin la majorité des MP sont d’origine plaquettaire et exposent de la PS. Il existe une corrélation entre la concentration en MP plasmatiques exposant de la PS et le développement de pathologies thrombotiques. La FCM est la méthode de référence dans l’étude des MP cependant leur détection est rendue difficile par leur petite taille. J’ai appliqué aux MP plasmatiques le test de dosage développé pour les liposomes. Les résultats obtenus sont prometteurs et permettent d’envisager le développement d’un test de dosage de l’ensemble des MP exposant de la PS.