Etude par microscopie électronique des mécanismes d'action de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes

Abstract

La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action.