Analyse de l'ubiquitination induite par UBE3A et de son rôle dans la régulation de l'excitabilité du cortex préfrontal

Abstract

L'absence d'ubiquitine E3 ligase UBE3A fonctionnelle dans le cerveau entraîne un trouble neurodéveloppemental rare, le syndrome d'Angelman (SA), associé à des altérations de la fonction du cortex préfrontal (CPF) et à des troubles cognitifs. La surexpression d'UBE3A, en revanche, entraîne un syndrome Dup15q lié à un trouble du spectre autistique. Bien que la base génétique du syndrome d'Angelman et la physiopathologie observée chez l'homme et dans des modèles animaux de ce syndrome aient été largement décrites, les mécanismes moléculaires régulés par l'ubiquitination médiée par UBE3A dans le cerveau restent insaisissables. Il est donc impératif non seulement d'identifier les substrats neuronaux d'UBE3A et d'autres protéines impliquées dans la voie ubiquitine-protéasome, mais aussi de comprendre la fonction neurologique de ces protéines.Dans ce travail, nous avons identifié plusieurs substrats neuronaux d'ubiquitination d'UBE3A. Pour ce faire, nous avons analysé les données protéomiques d'échantillons de cerveau d'une souris surexprimant UBE3A croisée avec une souris bioUb, un outil de découverte in vivo permettant d'isoler, d'identifier et de quantifier par spectrométrie de masse les protéines ubiquitinées de manière endogène. Nous avons constaté que l'ubiquitination d'UBE3A cible principalement les protéines synaptiques, ce qui expliquerait les altérations comportementales, cognitives et fonctionnelles observées dans le syndrome d'Angleman. Nous avons également validé, à l'aide d'un test pull-down GFP, les substrats candidats d'UBE3A DDI1 et DDI2, précédemment identifiés chez Drosophila melanogaster et dans des cellules humaines.Nous avons également montré que le substrat DDI2 d'UBE3A pourrait jouer un rôle dans la régulation de l'excitabilité du cortex préfrontal. En développant un modèle de knockdown de DDI2 médié par shRNA et en effectuant des enregistrements in vitro de neurones pyramidaux de la couche V du cortex prélimbique dans le CPF, nous avons pu découvrir des altérations de plusieurs paramètres de l'excitabilité neuronale, y compris un seuil de potentiel d'action plus bas et une augmentation du taux maximal de changement du potentiel d'action. Il reste à élucider comment cette protéine protéasomique pourrait induire ces changements et si ces changements sont liés au syndrome d'Angelman.L'ubiquitination des protéines n'est pas seulement modulée par les ligases E3, mais aussi par les enzymes de déubiquitination (DUBs). L'identification et la caractérisation des DUB responsables de la neutralisation d'UBE3A pourraient conduire à des cibles thérapeutiques susceptibles d'améliorer les symptômes du SA. Une étude précédente de notre laboratoire a démontré que USP9X, une DUB associée à la déficience intellectuelle liée à l'X, contrecarre l'ubiquitination médiée par UBE3A. Dans cette thèse, nous avons réalisé des enregistrements in vitro par patch clamp dans des tranches corticales de souris C57BL/6 en nous concentrant sur les cellules pyramidales de la couche V du cortex prélimbique, l'un des principaux types de neurones de sortie du CPF, et nous avons mesuré plusieurs paramètres d'excitabilité neuronale tout en inhibant l'activité de USP9X avec deux inhibiteurs spécifiques, WP1130 et FT709. Nous avons constaté que le blocage de USP9X avec WP1130 conduit à des changements dans plusieurs paramètres de l'excitabilité neuronale, les plus importants étant une augmentation du rapport sag et du milieu après hyperpolarisation. Nos résultats suggèrent que l'UPS9X régule l'activité ou l'expression de différents canaux ioniques qui contribuent aux propriétés intrinsèques régulant les propriétés membranaires de base et l'intégration synaptique.