Caractérisation de nouvelles protéines partenaires et développement de Nanobodies, spécifiques de la protéine BILBO1, composant majeur de la poche flagellaire chez le parasite Trypanosoma brucei

Abstract

Le trypanosome est un parasite protiste unicellulaire flagellé appartenant à l’ordre des Kinétoplastidés et transmis par l’intermédiaire d’un vecteur, la mouche tsé-tsé (Glossina sp.). Certaines espèces, dont Trypanosoma brucei, sont des pathogènes majeurs responsables de la trypanosomiase humaine ou « Maladie du sommeil » et animale. Ces dernières années, les avancées de la recherche ont apporté des connaissances majeures sur la biologie du parasite et des maladies associées. Mais le besoin de nouveaux traitements et d’outils de diagnostic reste une priorité (www.who.int), aucun vaccin n’étant disponible à ce jour. De plus, ce parasite unicellulaire s’avère être un excellent modèle d’étude cellulaire, son génome est séquencé, annoté et les protéines associées localisées (http://tryptag.org/). Il est utilisé comme modèle dans l’étude des anomalies de l’appareil flagellaire chez le spermatozoïde, ainsi que dans l’étude des ciliopathies chez l’Homme. Le trypanosome possède une invagination caractéristique de sa membrane plasmique au niveau de la région postérieure appelée la poche flagellaire (FP). Cet organite unique est maintenu par un collier appelé collier de la poche flagellaire (FPC) qui est le site exclusif d’endocytose et d’exocytose de ce parasite et, contribue au mécanisme d’échappement du système immunitaire. En 2008, la protéine du cytosquelette BILBO1, premier composant du FPC, a été découverte par l’équipe du Dr. D. Robinson et du Dr. M. Bonhivers.Les objectifs de ma thèse ont été d’une part d’identifier et de caractériser de nouvelles protéines partenaires de BILBO1 et d’autre part de développer des Nanobodies comme nouveaux outils d’étude de cette protéine. Nous avons pu, dans un premier temps, identifier et sélectionner dix nouvelles protéines partenaires de BILBO1 par l’utilisation de la technique de double hybride chez la levure puis, dans un deuxième temps, réaliser une caractérisation fonctionnelle de ces partenaires en combinant deux approches : l’étiquetage endogène et la diminution du niveau d’expression protéique par ARN interférent (ARNi). Cette première étape nous a menés à l’identification de plusieurs candidats dont une nouvelle protéine dénommée TFK1 (Transition fibres Kinetoplastid specific protein 1). En développant de nouvelles techniques dont la microscopie d’expansion (ExM), nous avons pu montrer que TFK1 était localisée au niveau du corps basal mature, et plus précisément dans une région encore peu connue chez le trypanosome, les fibres de transition (FT). L’utilisation de l’ARNi a montré que TFK1 était essentielle chez la forme différenciée du parasite (ou bloodstream form) responsable de l’infection chez les mammifères et engendrait un changement drastique dans la morphologie du parasite lors de sa division. Ces résultats, nous permettent de proposer une fonction de la protéine TFK1 dans l’initiation et la mise en place du sillon de division cellulaire lors de la cytokinèse du parasite.Le second objectif de ma thèse a été le développement de Nanobodies comme nouveaux outils moléculaires dans l’étude de la protéine BILBO1. Nous avons pu d’abord identifier et sélectionner un Nanobody, le Nb48 spécifique de la protéine BilbO1. Nous avons pu le produire, le purifier et valider son utilisation comme outil d’étude par les techniques de western blot et d’immunofluorescence. Nous avons également pu démontrer son utilisation en tant qu’Intrabody (iNbs) capable de bloquer la fonction de la protéine BILBO1 lorsqu’il est exprimé dans le cytoplasme du parasite. L’utilisation des Nbs étant en très forte expansion ces dernières années, que ce soit en biologie moléculaire et cellulaire, en microscopie, en diagnostique et en thérapeutique, nos résultats ouvrent la voie à de nouvelles approches chez le trypanosome et pour d’autres pathogènes.